09.11.2022 - International society for optics and photonics (SPIE)

Computergestützte Mikroskopie im Hochdurchsatzverfahren

Neuer Ansatz für quantitative Phasenmikroskopie mit hohem Durchsatz zeigt das Potenzial für die Beschreibung subzellulärer Strukturen in groß angelegten Zellstudien

Zellorganellen sind an einer Vielzahl von zellulären Lebensvorgängen beteiligt. Ihre Funktionsstörungen stehen in engem Zusammenhang mit der Entstehung und Metastasierung von Krebs. Die Erforschung subzellulärer Strukturen und ihrer anormalen Zustände ermöglicht Einblicke in die Mechanismen von Pathologien, was eine frühzeitige Diagnose für eine wirksamere Behandlung ermöglichen kann.

Das Lichtmikroskop, das vor mehr als 400 Jahren erfunden wurde, ist zu einem unverzichtbaren und allgegenwärtigen Instrument für die Untersuchung mikroskaliger Objekte in vielen Bereichen von Wissenschaft und Technik geworden. Insbesondere die Fluoreszenzmikroskopie hat mehrere Sprünge vollzogen - von der 2D-Weitwinkelmikroskopie über die konfokale 3D-Fluoreszenzmikroskopie bis hin zur hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie - und damit die Entwicklung der modernen Biowissenschaften erheblich gefördert.

Mit herkömmlichen Mikroskopen haben Forscher derzeit Schwierigkeiten, einen ausreichenden intrinsischen Kontrast für ungefärbte Zellen zu erzeugen, da diese nur eine geringe Absorption oder schwache Streuung aufweisen. Spezifische Farbstoffe oder fluoreszierende Markierungen können bei der Visualisierung helfen, aber die Langzeitbeobachtung lebender Zellen ist nach wie vor schwer zu erreichen.

In jüngster Zeit hat sich die quantitative Phasenbildgebung (QPI) als vielversprechend erwiesen, da sie die Phasenverzögerung von unmarkierten Proben auf zerstörungsfreie Weise quantifizieren kann. Der Durchsatz einer Bildgebungsplattform wird jedoch grundsätzlich durch das Raum-Bandbreiten-Produkt (SBP) des optischen Systems begrenzt, und die SBP-Erhöhung eines Mikroskops wird durch die maßstabsabhängigen geometrischen Aberrationen seiner optischen Elemente grundlegend beeinträchtigt. Dies führt zu einem Kompromiss zwischen der erreichbaren Bildauflösung und dem Sichtfeld (FOV).

Ein Ansatz zur markierungsfreien, hochauflösenden mikroskopischen Bildgebung mit großem Sichtfeld ist erforderlich, um eine präzise Erkennung und quantitative Analyse subzellulärer Merkmale und Ereignisse zu ermöglichen. Zu diesem Zweck haben Forscher der Nanjing University of Science and Technology (NJUST) und der University of Hong Kong kürzlich eine markierungsfreie Hochdurchsatz-Mikroskopie-Methode entwickelt, die auf hybriden Hell-/Dunkelfeld-Beleuchtungen basiert. Wie in der Fachzeitschrift Advanced Photonics berichtet, erweitert der Ansatz des "hybriden Hellfeld-Dunkelfeld-Intensitätstransports" (HBDTI) für die quantitative Phasenmikroskopie mit hohem Durchsatz die zugänglichen räumlichen Frequenzen der Probe im Fourier-Raum erheblich, wodurch die maximal erreichbare Auflösung um etwa das Fünffache über die Beugungsgrenze der kohärenten Bildgebung hinaus gesteigert wird.

Basierend auf dem Prinzip des Beleuchtungsmultiplexing und der synthetischen Apertur wird ein Vorwärtsabbildungsmodell des nichtlinearen Hellfeld- und Dunkelfeld-Intensitätstransports entwickelt. Dieses Modell verleiht HBDTI die Fähigkeit, Merkmale jenseits der kohärenten Beugungsgrenze zu liefern. Unter Verwendung eines handelsüblichen Mikroskops mit einem 4-fachen 0,16NA-Objektiv demonstrierte das Team die HBDTI-Bildgebung mit hohem Durchsatz und erreichte eine Bildauflösung von 488 nm halber Breite in einem FOV von etwa 7,19 mm2, was eine 25-fache Steigerung des SBP im Vergleich zur kohärenten Beleuchtung ergab.

Die nicht-invasive Hochdurchsatz-Bildgebung ermöglicht die Darstellung subzellulärer Strukturen in groß angelegten Zellstudien. Laut dem korrespondierenden Autor Chao Zuo, Leiter des Smart Computational Imaging Laboratory (SCILab) an der NJUST, "bietet HBDTI ein einfaches, leistungsstarkes, kostengünstiges und universelles Bildgebungswerkzeug für die quantitative Analyse in den Biowissenschaften und der biomedizinischen Forschung. Angesichts seiner Fähigkeit zur QPI mit hohem Durchsatz wird HBDTI voraussichtlich eine leistungsstarke Lösung für die skalenübergreifende Erkennung und Analyse subzellulärer Strukturen in einer großen Anzahl von Zellclustern bieten." Zuo merkt an, dass weitere Anstrengungen erforderlich sind, um die Hochgeschwindigkeits-Implementierung von HBDTI bei der Analyse großer Gruppen von lebenden Zellen zu fördern.

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