20.03.2020 - University of Toronto

Neue leistungsfähigere Methode zur Genombearbeitung

Wissenschaftler können jetzt mehrere Genomfragmente gleichzeitig bearbeiten

Wissenschaftler aus Toronto können mehrere Stellen im Genom gleichzeitig bearbeiten, um zu lernen, wie verschiedene DNA-Abschnitte bei Gesundheit und Krankheit zusammenarbeiten.

Die auf CRISPR basierende DNA-Editierung hat die Untersuchung des menschlichen Genoms revolutioniert, indem sie die präzise Deletion jedes menschlichen Gens ermöglicht, um Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Doch ein Merkmal blieb eine Herausforderung - die Fähigkeit, mehrere Gene oder Genfragmente in derselben Zelle gleichzeitig zu entfernen. Dennoch ist diese Art der Genomchirurgie der Schlüssel für Wissenschaftler, um zu verstehen, wie verschiedene Teile des Genoms im Kontext der normalen Physiologie und der Krankheit zusammenwirken.

Jetzt gibt es ein solches Werkzeug dank der Teams von Benjamin Blencowe und Jason Moffat, beide Professoren für Molekulargenetik am Donnelly-Zentrum für Zell- und Biomolekularforschung. Die Methode kann auf jede Art von Säugetierzelle angewendet werden, um die DNA systematisch an mehreren Stellen gleichzeitig zu zielen, wie in einer in der Zeitschrift Nature Biotechnology veröffentlichten Studie beschrieben wird.

CRISPR wird oft als Genomschere beschrieben und funktioniert, indem ein DNA-Schneiden-Enzym über Leit-RNA-Moleküle, die so konstruiert sind, dass sie an der Zielstelle haften, an gewünschte Stellen im Genom geschickt wird. Das am weitesten verbreitete DNA-Schneidenzym ist Cas9.

Seitdem Cas9 zum ersten Mal ans Licht kam, wurden von Wissenschaftlern, die die Anwendungen der Technologie verbessern und erweitern wollen, weitere Cas-Enzyme mit bestimmten Eigenschaften identifiziert. Im Gegensatz zur CRISPR-Cas9-Technologie kombiniert CHyMErA zwei verschiedene DNA-Schneidende Enzyme, Cas9 und Cas12a, um vielseitigere Anwendungen zu ermöglichen. Cas12a ist ein Enzym, das zur Erzeugung mehrerer Leit-RNA-Moleküle in derselben Zelle verwendet werden kann, was für die gleichzeitige DNA-Editierung von entscheidender Bedeutung ist.

Thomas Gonatopoulos-Pournatzis, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in Blencowes Gruppe, hatte mehrere Jahre damit verbracht, kombinatorische Genbearbeitung zu entwickeln, indem er die Cas9- und Cas12a-Enzyme selbst getestet hat. Er hatte dann die Idee, diese Enzyme zu kombinieren, um das CHyMErA-System zu erzeugen.

"Wir hatten eine Reihe von Ansätzen versucht, um Deletionen von Genfragmenten zu induzieren, und nichts funktionierte so gut wie CHyMERA", sagt er. "Ich war begeistert, als wir zusammen mit Shaghayegh Farhangmehr, einer Doktorandin im Labor in Blencowe, den ersten Beweis dafür sahen, dass CHyMErA erfolgreich Genabschnitte deletiert. Wir haben diese Ergebnisse am zweiten Weihnachtsfeiertag erhalten, und es war das beste Weihnachtsgeschenk, das ich mir hätte wünschen können".

Der nächste Schritt war die Nutzung von CHyMErA in groß angelegten Screens, um systematisch zu analysieren, wie die Gene zusammenwirken und welche Funktionen die einzelnen Teile der Gene haben. Blencowes Team, das die Regulation und Funktion von Genabschnitten, den so genannten Exons, untersucht, wandte sich an Moffat, dessen Gruppe umfangreiche Erfahrungen mit der CRISPR-Technologie gesammelt hatte.

"Mit CHyMErA können Sie das beste der beiden Enzyme verwenden", sagt Michael Aregger, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter im Moffat-Labor, der bei der Entwicklung der bildschirmbasierten Anwendungen von CHyMErA eine Schlüsselrolle spielte. "Cas9 wurde von der Gemeinschaft verbessert, um eine sehr hohe Bearbeitungseffizienz zu erreichen, während Cas12a das Multiplexing von Leit-RNAs ermöglicht und somit eine viel größere Flexibilität bei der Suche nach Stellen im Genom bietet, die wir schneiden können.

In einer Anwendung von CHyMErA zielten die Forscher auf Genpaare, die als Paraloge bezeichnet werden, die einen ähnlichen DNA-Code haben, aber nur unzureichend untersucht wurden, weil sie schwer zu erforschen waren. Da die Paralogs durch die Duplikation eines angestammten Gens entstanden sind, war man davon ausgegangen, dass sie weitgehend ähnliche Funktionen haben würden. Aber ihre Funktion konnte durch die bestehenden Methoden der Einzelgen-Zielsuche, die typischerweise bei genetischen Screens eingesetzt werden, nicht aufgedeckt werden, vor allem weil der andere Paraloge den fehlenden kompensieren würde.

"Mit CHyMErA können wir beide Paraloge paarweise herausnehmen, um zu sehen, ob diese angestammte Funktion für das Überleben der Zelle wichtig ist", sagt Kevin Brown, leitender Forschungsmitarbeiter im Moffat-Labor und zusammen mit Aregger und Gonatopoulos-Pournatzis Co-Leitautor der Studie. "Wir sind jetzt in der Lage, eine Klasse von Genen zu befragen, die zuvor nicht berücksichtigt wurde.

Nach dem Ausschalten von ~700 Paralogspaaren, fast allen im menschlichen Genom vorhandenen, bestätigte die Analyse, dass viele dieser Genpaare tatsächlich ähnliche Funktionen für das Überleben der Zellen erfüllen, während andere unterschiedliche Funktionen haben.

Ein weiteres Merkmal von CHyMErA ist, dass sowohl Cas9 als auch Cas12a an nahegelegenen Genomstellen eingesetzt werden können, um Genfragmente wie Exons herauszuschneiden. Dies ermöglichte es dem Team, Tausende von Exons einzeln zu löschen, die mit Krebs und Hirnfunktionen in Verbindung gebracht wurden, aber nicht mit Cas9 allein angegriffen werden konnten. Die Exons werden variabel in die Transkripte der Gene aufgenommen und können die Funktion der kodierten Proteine verändern, obwohl weitgehend unbekannt ist, wie einzelne Exons zu den zellulären Prozessen beitragen. Von den 2.000 Exons, die von CHyMErA analysiert wurden, erwiesen sich über 100 als entscheidend für das Überleben der Zellen, so daß sich die zukünftige Forschung nun darauf konzentrieren kann, ihre potentielle Rolle bei der Krankheit zu beleuchten.

"Wenn wir erst einmal die Exons identifiziert haben, die eine kritische Rolle bei der Krankheit spielen, können wir diese Informationen nutzen, um neue Therapien zu entwickeln", sagt Gonatopoulos-Pournatzis.

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