11.08.2022 - Instituto de Investigación Biomédica (IRB Barcelona)

Genbearbeitung mittels CRISPR/Cas9 kann zu Zelltoxizität und Genominstabilität führen

Forscher identifizieren kritische Stellen im Genom, an denen Gen-Editing eine unerwünschte Reaktion hervorrufen könnte, und geben Empfehlungen für sicherere Ansätze

CRISPR/Cas9 ist eine weit verbreitete, sehr präzise Gen-Editing-Technik, deren Entwicklung durch Jennifer A. Doudna und Emmanuelle Charpentier mit dem Nobelpreis für Chemie 2020 gewürdigt wurde. CRISPR wird auch als "genetische Schere" bezeichnet und ermöglicht es, die gewünschte DNA-Sequenz an (fast) jeder Stelle des Genoms einzufügen und so ein Gen zu verändern oder zu deaktivieren. Diese Technik ist in der biomedizinischen Forschung weit verbreitet, und einige CRISPR-basierte Therapien befinden sich in der klinischen Erprobung, u. a. zur Behandlung von menschlichen Blutkrankheiten, einigen Krebsarten und HIV.

Wissenschaftler des IRB Barcelona unter der Leitung des ICREA-Forschers Dr. Fran Supek haben nun berichtet, dass CRISPR-Gen-Editing je nach Zielstelle im menschlichen Genom zu Zelltoxizität und genomischer Instabilität führen kann. Dieser unerwünschte Effekt wird durch das Tumorsuppressorprotein p53 vermittelt und durch die DNA-Sequenz in der Nähe der Editierstelle und verschiedene epigenetische Faktoren in der Umgebung bestimmt.

Mithilfe von Berechnungsmethoden haben Forscher des Genome Data Science Labs die populärste CRISPR-Bibliothek, die für menschliche Zellen entwickelt wurde, analysiert und 3.300 gezielte Stellen aufgespürt, die starke toxische Wirkungen zeigen. Die in der Zeitschrift Nature Communications veröffentlichte Arbeit zeigt außerdem, dass etwa 15 % der menschlichen Gene mindestens einen toxischen Editierpunkt enthalten.

"Unsere Arbeit befasst sich mit einem wichtigen Thema, nämlich der TP53-assoziierten Toxizität von Cas9, die in letzter Zeit kontrovers diskutiert wurde, und sie liefert auch Richtlinien, wie das Problem umgangen werden kann. Die Vermeidung des Editierens an diesen "riskanten" Stellen würde das CRISPR-Editing nicht nur effizienter, sondern vor allem auch sicherer machen", erklärt Dr. Supek.

Ein bestimmtes Gen kann an einer Vielzahl von Stellen editiert werden. "Die Regionen des Gens, die für die Regulierung wichtig sind oder bestimmte epigenetische Marker aufweisen, sind diejenigen, die am ehesten die p53-Reaktion auslösen und sollten daher generell vermieden werden", sagt Dr. Miguel-Martin Álvarez, einer der leitenden Forscher der Studie.

p53-vermittelte Toxizität und Tumorentstehung

p53 ist ein Protein, das als Wächter des Genoms bekannt ist. Es erkennt DNA-Schäden und veranlasst die Zellen dazu, ihre Teilung zu stoppen und den programmierten Tod herbeizuführen, wodurch sie daran gehindert werden, sich zu vermehren und die "Fehler" in ihrer DNA zu vergrößern. Daher liegt p53 ein natürlicher Schutzmechanismus gegen Krebs und andere durch DNA-Schäden verursachte Komplikationen zugrunde.

Bei der CRISPR-Geneingabe müssen häufig beide DNA-Stränge durchtrennt werden. In einigen Fällen kann diese Manipulation eine p53-Reaktion auslösen, bei der die bearbeiteten Zellen als geschädigt "markiert" werden und dann eliminiert werden, wodurch die Effizienz des Gen-Editierens verringert wird.

Die Hauptkomplikation in Bezug auf p53 und Gen-Editing besteht jedoch darin, dass Zellen, die das CRISPR-Editing überwinden, dies möglicherweise gerade aufgrund einer Funktionsstörung von p53 tun. Das heißt, dass diese Zellen möglicherweise weniger in der Lage sind, DNA-Schäden zu erkennen und/oder Zellen für den programmierten Tod zu markieren. Infolgedessen könnte das Gen-Editing-Verfahren am Ende Zellpopulationen mit instabilen Genomen begünstigen, was bedeutet, dass sie anfällig für die Anhäufung weiterer Mutationen sind, wodurch sich das Risiko der Entwicklung bösartiger Erkrankungen erhöht.

"Diese unerwünschte Folge könnte das Risiko einer genomischen Instabilität mit sich bringen, was im Zusammenhang mit Ex-vivo-CRISPR-Therapien, bei denen Zellen eines Patienten im Labor bearbeitet und dem Patienten wieder zugeführt werden, höchst unerwünscht ist. Wir hoffen, dass unsere Studie einige Leitlinien für die Entwicklung sichererer CRISPR-Reagenzien liefert und zu weiteren Forschungen zu diesem Thema anregt", schließt Dr. Supek.

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