28.01.2022 - Chinese Academy of Sciences

Neue Sequenzierungstechnik für biomassearme, degradierte oder kontaminierte Mikrobiomproben etabliert

Ein Forscherteam unter der Leitung des Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology (QIBEBT) der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (CAS) hat eine kostengünstige Technik zur Sequenzierung von Metagenomen entwickelt. Sie ermöglicht die hochauflösende Offenlegung der gesamten "Landschaft" der Organismen in einem Mikrobiom, selbst bei Proben mit geringer Biomasse, die degradiert oder kontaminiert sind. Ihre Studie wurde am 26. Januar in der Zeitschrift Genome Biology veröffentlicht.

Das "Mikrobiom" ist die Gemeinschaft von Bakterien, Pilzen, Protisten und Viren, die im und auf dem Menschen oder auch in jedem anderen Lebensraum lebt. Um herauszufinden, welche Mikroben zu einem bestimmten Mikrobiom gehören, müssen Forscher eine metagenomische Sequenzierung durchführen, d. h. die Sequenzierung des genetischen Materials mehrerer Organismen zur gleichen Zeit.

Doch selbst bei der modernsten metagenomischen Sequenzierung gibt es noch viele schwerwiegende Einschränkungen. Es gibt zwei Hauptkategorien des Verfahrens: die Amplikon-Sequenzierung und die Sequenzierung des gesamten Metagenoms (whole metagenome sequencing, WMS).

Die Amplikon-Sequenzierung ist billig. Leider liefert sie nur Informationen über die Mitglieder des Mikrobioms auf der taxonomischen Ebene der Gattung. Taxonomische Informationen auf Art- oder Stammebene lassen sich nur schwer herausfiltern. Die Amplikon-Sequenzierung leidet auch darunter, dass sie nur Bakterien oder Archaeen oder Pilze oder Viren identifizieren kann, anstatt sie alle auf einmal zu identifizieren.

Mit WMS können ganze DNA-Sequenzen von allen in der Probe enthaltenen Bakterien, Archaeen, Pilzen und Viren erfasst werden, und zwar mit einer höheren taxonomischen Auflösung. Dies liefert viel mehr Informationen, ist aber auch sehr viel kostspieliger. WMS erfordert außerdem eine große Menge an hochwertiger DNA.

"Was wir brauchen, ist eine kostengünstige Sequenzierungsmethode, die eine genaue Identifizierung aller Mikroben in Artenauflösung zur gleichen Zeit ermöglicht und mit Proben mit geringer Biomasse umgehen kann", so SUN Zheng, Erstautor der Studie und Forscher am Single-Cell Center des QIBEBT.

Die Forscher entwickelten eine Methode, die sie "2bRAD-Sequenzierung für das Mikrobiom" oder kurz 2bRAD-M nennen. Dabei kommt die Restriktionsstellen-assoziierte DNA-Sequenzierung (RADseq) zum Einsatz, bei der Restriktionsenzyme vom Typ IIB (Proteine, die DNA an bestimmten Stellen entlang des Moleküls spalten) verwendet werden, um genomische DNA aus Stuhl-, Haut- oder Umweltproben in Fragmente von 25-33 Basenpaaren (Nukleotidpaaren) zu zerlegen.

Das 2bRAD-M-Verfahren sequenziert nur diese verdauten Fragmente - also nur etwa ein Prozent des Metagenoms - und kann Profile von Bakterien, Archaeen und Pilzen erstellen, und zwar bis auf die Ebene der Arten, nicht nur der Gattungen.

"Da nur ein einziges Pikogramm (ein Tausendstel eines Nanogramms) der Gesamt-DNA benötigt wird, kann das Verfahren kostengünstig und genau hochauflösende Profile erstellen, selbst für schwer zu sequenzierende Proben, bei denen eine hohe Verunreinigung der Wirts-DNA vorliegt oder die DNA stark fragmentiert oder anderweitig degradiert ist", so HUANG Shi, Co-Erstautor der Studie.

Eine der faszinierendsten Entdeckungen der letzten Jahre war, dass Mikroben an der Krebsentwicklung beteiligt sind. Mit Hilfe von 2bRAD-M konnten die Forscher zeigen, dass die Mikrobiom-Profile von Gebärmutterhalskrebs-Gewebe empfindlich und zuverlässig aus formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Proben ermittelt werden können, die in der Regel eine geringe Menge an menschlicher DNA enthalten, degradiert oder kontaminiert sind. Solche Profile können potenziell für die Frühdiagnose von Gebärmutterhalskrebs eingesetzt werden.

"Wir hoffen, dass wir in Zukunft die 2bRAD-M-Technik weiterentwickeln und ihre verschiedenen klinischen Anwendungsmöglichkeiten erforschen können", sagte der Hauptautor XU Jian, Direktor des Einzelzellzentrums am QIBEBT. "Letztendlich hoffen wir, dass 2bRAD-M ein kosteneffizientes, populäres Werkzeug für die Mikrobiomforschung wird und verschiedene schwierige Aufgaben bewältigt, die mit den derzeitigen Techniken nicht zu bewältigen sind", fügte Prof. WANG Shi von der Ocean University of China, ein weiterer Hauptautor der Studie, hinzu.

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