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Kostenloses eBook: Markierungsfreie Analysemethoden: Technologien, wichtige Überlegungen und Anwendungen

Echtzeit-Analyse von biomolekularen Wechselwirkungen unter nativen biologischen Bedingungen

FortéBio by Molecular Devices (Germany) GmbH

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Die kinetische Charakterisierung mittels markierungsfreier Detektion kann markierungsabhängige Endpunktmessungen wie ELISA oder fluorometrische Methoden problemlos ersetzen. Echtzeit-Biosensor-Analysen ermöglichen es, den Fortschritt des Assays zu verfolgen. Die Bindungsaffinität ergibt sich aus der Messung von Assoziation (ka) und Dissoziation (kd) und bildet somit eine vollständige kinetische Charakterisierung ab.

Kinetische & Affinitätscharakterisierung - Während ELISA die dominante Technik in der Affinitätscharakterisierung von Biomolekülen war, sind mar-kierungsfreie Technologien in Echtzeit immer beliebter, da diese in der Lage sind, detaillierte Informationen zur Kinetik der Bindung von Biomolekülen zu liefern. Außerdem können schnelle, empfindlichere Quantifizierungsergeb-nisse, über einen weiten dynamischen Bereich, gemessen werden.

Zelllinienentwicklung – Markierungsfreie Methoden finden auch Anwendung in der Entwicklung stabiler Zelllinien, die in einer Reihe wichtiger Anwendun-gen Verwendung finden, darunter die Herstellung von Biologika (z.B. re-kombinantes Protein und monoklonale Antikörper), Wirkstoff-Screenings und Genfunktionsstudien

Bioprozesstechnik - Titer- und Verunreinigungsprüfung - Von vorgelagerten Prozessen wie der Entwicklung von Zelllinien bis hin zu nachgelagerten Prozessen wie der dynamischen Bindungskapazitätsbewertung von Reini-gungssäulen, der Prüfung von Produktverunreinigungen, Titer usw. sind markierungsfreie analytische Techniken zur Effizienzsteigerung bei gleich-bleibender oder verbesserter Qualität für die Entwicklung biopharmazeuti-scher Arzneimittel entscheidend.

Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen dienen als Schlüsselauslöser für viele biologische Prozesse und sind daher ein ideales Ziel für die Entwicklung neuer Wirkstoffe. Biologische Bindungsinteraktionen sind dynamische Prozesse, die durch Veränderungen der Umwelt beeinflusst werden. Daher müssen die Techniken zur Charakterisierung dieser Wechselwirkungen die biologische Komplexität widerspiegeln, um die Bindesysteme bestmöglich abzubilden.

Zu den gebräuchlichsten markierungsfreien Analyseplattformen gehören Bio-Layer Interferometrie (BLI), Surface Plasmon Resonance (SPR), Isothermal Titration Calorimetry (ITC) und Microscale Thermophoresis (MST). In diesem E-Book werden die vier Technologien in Bezug auf ihre Möglichkeiten und Arbeitsabläufe verglichen, um die Entscheidung für die am besten geeignete Plattform, in Abhängigkeit der Anwendung, zu erleichtern.

Schlüsselattribute wie Durchsatz, Probenkapazität, Laufzeiten, Affinitätsbereiche, Sensitivität, Art der Probenmatrix und Benutzerfreundlichkeit sind wichtige Faktoren bei der Auswahl einer Biosensorplattform, die den jeweiligen Anforderungen entspricht.

Sowohl die Octet^® BLI- als auch die Pioneer SPR-Plattform sind in der Lage, ein breites Spektrum an biomolekularen Wechselwirkungen zu charakterisieren. Die Pioneer SPR-Systeme sind aufgrund ihrer hervorragenden Empfindlichkeit ideal für kleine Moleküle und für Fragment-Screening (> 70 Da) geeignet. Die BLI-Plattformen können für Analyten > 150 Da und Anwendungen mit größeren Molekulargewichten wie Viren, Nanopartikeln, Liposomen und Zellen eingesetzt werden.

Octet Systeme besitzen keine mikrofluidischen Komponenten und messen die Proben direkt in Mikrotiterplatten. Bis zu 96 gleichzeitige Messungen sind eine ideale Voraussetzung ungereinigten Proben, wie Zellkulturüberstände, Lysate oder komplexen Mischungen, im routinierten Hochdurchsatz zu bearbeiten. Der hohe Probendurchsatz ungereinigter Proben ist besonders nützlich bei Epitop-Binning, Quantifizierung, Off-Rate-Ranking oder großen Screening-Assays, bei denen eine Aufreinigung der Proben für effiziente Arbeitsabläufe nicht möglich ist.

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