Drei Buchstaben in aller Munde: PCR. Bis vor kurzem waren sie nur Fachleuten der Medizin und Molekularbiologie ein Begriff. Seit dem Ausbruch der Corona-Pandemie dagegen hat fast jedes Kindergartenkind schon einmal davon gehört! Die Polymerase Kettenreaktion PCR (engl. Polymerase Chain Reaction) ist neben Abstands- und Hygieneregeln, Antigen-Schnelltests und Impfen zu einer der wichtigsten Strategien im Umgang mit SARS-CoV-2, dem neuartigen Coronavirus, geworden. Doch nur weil man weiß, dass man mit einem PCR Test relativ sicher eine Infektion mit dem Virus nachweisen kann, ist ja noch lange nicht geläufig, was sich eigentlich genau dahinter verbirgt – nämlich eine genial einfache Methode zur Vervielfältigung von DNA, des Trägers der Erbinformationen aller Lebewesen. Und das gelingt dabei sogar aus kleinsten Spuren DNA. Ob in Medizin und Diagnostik, Lebensmittelanalytik oder Forensik – die Anwendungsgebiete der PCR Methode sind daher vielfältig und gehen weit über die Coronapandemie hinaus.
Wie aber funktioniert die PCR Methode genau? Welche Prinzipien der Molekularbiologie stecken dahinter und welche Varianten gibt es? Wir erklären eine der wichtigsten Methoden der Molekularbiologie.
Inhalt
- Basiswissen: Was ist PCR?
- Die PCR Methode im Detail: Materialien, Technisches Equipment und Ablauf
- Weiterentwicklung: Varianten der PCR Methode
1. Basiswissen im Schnelldurchlauf: Definition der PCR
Für die Entwicklung der Polymerase Kettenreaktion PCR (engl. Polymerase Chain Reaction) erhielt der US-amerikanische Biochemiker Kary Bank Mullis 1993 bereits sieben Jahre nach seiner bahnbrechenden Erfindung den Nobelpreis für Chemie – gemeinsam mit dem kanadischen Chemiker Michael Smith. Denn das gewaltige Potential, das hinter der PCR Methode steckt, wurde schnell klar: Mit wenigen Materialien und einer Wärmequelle, dem sogenannten Thermocycler, lassen sich kurze DNA Fragmente aus kleinsten Mengen der Erbsubstanz DNA vervielfältigen.
Der Begriff Polymerase Kettenreaktion bezieht sich dabei auf das für die Methode eingesetzte Enzym DNA-Polymerase und die Tatsache, dass die notwendigen Schritte in mehrfacher Wiederholung immer mit dem jeweils zuvor vervielfältigten Material durchgeführt werden
2. Die PCR Methode im Detail: Materialien, Technisches Equipment und Ablauf
Die Ausgangsmaterialien
Wenig Materialaufwand und funktionales Equipment – mehr braucht es nicht, um den Baustein unseres Lebens zu vervielfältigen.
Für die PCR Methode muss die DNA Probe nicht aufgereinigt vorliegen. Durchgeführt wird die Vervielfältigung mit einem DNA Fragment in einer Pufferlösung – diese hält den pH-Wert während der gesamten Reaktion stabil. In das PCR-Reaktionsgefäß werden nun viele Nukleotide, also die einzelnen Bausteine der DNA, zugesetzt – aus ihnen entstehen später die entsprechenden Kopien des ursprünglichen DNA-Strangs. Für die Vervielfältigung zuständige Enzyme, die DNA-Polymerasen, werden ebenfalls benötigt. Man verwendet hitzestabile DNA-Polymerasen, die besonders bei höheren Temperaturen aktiv sind. Diese hitzeresistenten Polymerasen gewinnt man aus thermophilen Bakterien. Damit die Polymerase gut arbeiten kann, werden zusätzlich Magnesium-Ionen zugesetzt. Ebenso enthält die PCR Probe zwei verschiedene Primer, also kurze künstlich synthetisierte Nukleotidsequenzen – jeweils einen spezifischen für jeden Einzelstrang der DNA. Die Primer signalisieren der Polymerase den Anfang ihrer „Kopierarbeit“.
Die Reaktionsschritte der PCR Methode
Aufspalten, Anlagern, Vervielfältigen – in drei Schritten geht es in mehrfachen Wiederholungen zum Ziel. Durchgeführt wird die Polymerase Kettenreaktion in einem sogenannten Thermocycler. Diese Geräte fassen eine bestimmte Anzahl an Reaktionsgefäßen und können die für die folgenden drei Schritte notwendigen Temperaturen selbständig einstellen und dies entsprechend oft wiederholen, so dass die Vervielfältigung der DNA praktisch ohne manuelle Eingriffe ablaufen kann.
Damit Sie aus der Vielzahl, der heute auf dem Markt verfügbaren Geräte, auch das passende wählen, können Sie sich in der weltweit größten Marktübersicht Thermocycler über alle relevanten Hersteller mit ihren Produkten informieren.
Schritt 1: Aufspalten - Die Denaturierung
Die Reaktionsgefäße werden für eine kurze Zeit von ca. 20 bis 30 Sekunden auf etwa 95°C erhitzt. Bei dieser Temperatur werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden DNA Strängen gelöst und sie trennen sich in zwei Einzelstränge.
Schritt 2: Anlagern - Die Hybridisierung (auch Annealing)
Der Thermocycler kühlt das Gemisch nun ab. Dies muss schnell geschehen, damit sich die beiden Einzelstränge nicht wieder aneinanderlagern können. Stattdessen lagern sich die Primer an – je nach Primer benötigt man hier spezifische Temperaturen zwischen 50-60°C.
Schritt 3: Vervielfältigen - Die DNA-Synthese (auch Elongation)
Das Enzym DNA-Polymerase verlängert nun mit Hilfe der Nukleotide in der Pufferlösung den DNA Strang und setzt dazu an den kleinen doppelsträngigen Stücken an, die durch das Koppeln der Primer an den Einzelstrang entstanden sind. Dieser letzte Schritt wird bei einer Temperatur von ca. 70°C durchgeführt.
Insgesamt durchläuft die Probe diese drei Schritte nun zwischen 20 bis 50 Zyklen. Aus einem einzigen DNA Abschnitt lassen sich mit der Polymerase Kettenreaktion also innerhalb kürzester Zeit durch exponentielle Vervielfältigung Milliarden von Kopien des ursprünglichen DNA Abschnittes herstellen.
3. Weiterentwicklung: Varianten der PCR Methode
Seit der Einführung der PCR Methode Mitte der 1980er Jahre hat sich die Methodik rasant weiterentwickelt und eröffnet so eine Vielzahl an neuen Anwendungsmöglichkeiten. Aus der Fülle an interessanten Methoden seien hier nur einige genannt.
Quantitative Echtzeit-PCR (qPCR oder real-time PCR):
Möchte man die Menge des vervielfältigten DNA-Abschnitts bestimmen, gelingt dies mit quantitativer Echtzeit-PCR, auch real-time PCR oder kurz quantitative PCR (qPCR) genannt. Das Verfahren kann schnell und vollautomatisiert durchgeführt werden, wobei Vervielfältigung, Detektion und Quantifizierung in einem Schritt ablaufen. Durch Beimischung eines inaktiven Fluoreszenzfarbstoffs, der durch die DNA-Produktion aktiviert wird, kann bei jedem Zyklus (in Echtzeit) die Fluoreszenz gemessen und so Rückschlüsse auf die Menge an DNA geschlossen werden.
Reverse-transcription PCR (RT-PCR)
Nicht nur DNA lässt sich mittels PCR nachweisen, sondern auch RNA. Dies geschieht auf indirektem Weg mit Hilfe des Enzyms reverse Transkriptase. Es wandelt die von den thermostabilen DNA-Polymerasen nicht akzeptierte RNA in cDNA (komplementäre DNA) um. Mit dieser lässt sich dann in einem zweiten Schritt die PCR Methode durchführen.
Verwendet wird die RT-PCR in Forschung und Diagnostik, zum Beispiel um RNA nachzuweisen (Genexpression von spezifischen Genen in Zellen; Genom von RNA-Viren).
Error prone PCR
Aus Forschungssicht spannend ist die error prone PCR. Bei der Amplifikation/ Vervielfältigung der DNA mittels DNA-Polymerasen kann es auch zum Falscheinbau von Nucleotiden – und dadurch zu Sequenzabweichungen zur Ausgangs-DNA – kommen. Die Fehleinbaurate steigt mit dem Abweichungsgrad von den optimalen Reaktionsbedingungen. Für in-vitro-Evolutions-Experimente kann man also im Reagenzgefäß durch gerichtete Selektion, Vervielfältigung und Mutation Nucleinsäuren mit bestimmten Eigenschaften erzeugen.
Fazit
Die PCR Methode ist eine in Labor- und Lebensmittelanalytik, Forschung und Diagnostik weit verbreitete Methode zur Vervielfältigung von DNA, des Trägers der Erbinformationen aller Lebewesen, die aus kleinsten Spuren DNA gelingt. Wer mehr über die vielfältigen Anwendungsgebiete der PCR Methode sucht, findet in den Themenwelten PCR weitere Hintergrundinformationen und spannende Einblicke und in der weltweit größten Marktübersicht Thermocycler auch das passende Equipment.
„Basics-Glossar“
DNA
Die DNA (englisch deoxyribonucleic acid, deutsch Desoxyribonukleinsäure) ist eine aus unterschiedlichen Desoxyribonukleotiden aufgebaute Nukleinsäure. Ihre Grundbausteine sind die Nukleotide. Die DNA besteht aus zwei komplementären Einzelsträngen, die in Form einer Doppelhelix verknüpft sind.
Nukleotide
Das sind die Bausteine der Nukleinsäuren DNA und RNA (Ribonukleinsäure). Nukleotide bestehen jeweils aus einem Phosphatrest, dem Zucker Desoxyribose sowie einer von fünf Nukleinbasen. Für die DNA sind das Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin (abgekürzt A, T, G und C). In der Ribonukleinsäure ist Thymin durch Uracil (U) ersetzt.
Primer
Primer sind kurze künstlich synthetisierte Nukleotide.
(DNA) Polymerase
Polymerasen sind Enzyme, die die Polymerisation von Nukleotiden, den Grundbausteinen der Nukleinsäuren, katalysieren. Sie verknüpfen die Nukleotide in einer bestimmten Reihenfolge zu DNA oder RNA. Polymerasen sind also für die Vermehrung der Erbinformation über die Replikation der DNA zuständig (Zellteilung!). Auch für die Herstellung von Proteinen in der Zelle sind Polymerasen wichtig.
Es gibt verschiedene Arten von Polymerasen und sie kommen in allen Lebewesen vor.
