04.05.2020 - Consejo Superior De Investigaciones Científias (CSIC)

Wissenschaftler suchen nach schnelleren und billigeren SARS-CoV2-Detektoren als Molecular Beacon PCR

CINN-Projekt basiert auf DNA-'Sensoren', die durch Fluoreszenz in der Gegenwart von Coronavirus-RNA reagieren

Forscher des Spanischen Nationalen Forschungsrats (CSIC) schlagen eine schnellere, kostengünstigere und groß angelegte Alternativmethode zum Nachweis des SARS-CoV-2-Coronavirus zur PCR vor, die auf molekularen Leuchtfeuern basiert. Die Technik würde DNA-"Sensoren" einsetzen, die in der Gegenwart der Ziel-RNA (in diesem Fall der RNA des Coronavirus) fluoreszieren. Ziel ist es, das Vorhandensein von viraler RNA in der Probe auf direktem Wege und ohne die kostspieligen Zwischenschritte der Nukleinsäureamplifikation, die bei der PCR erforderlich sind, nachzuweisen. Das Projekt ist im Moment ein "proof of concept", aber vorläufige Ergebnisse zur Sensitivität und Spezifität der Technik werden in zwei Monaten erwartet. Den Forschern zufolge könnten dadurch die Verarbeitungskosten pro Probe um 50-70% gesenkt werden. Dies ist eines der fünf Projekte zur Diagnose, die vom Gesundheitsinstitut Carlos III (ISCIII), das dem Ministerium für Wissenschaft und Innovation untersteht, in ganz Spanien genehmigt wurden. Er wird vom Covid-19-Fonds des ISCIII mit 150.000 Euro finanziert.

Gegenwärtig ist die Polymerase-Kettenreaktionstechnik, auch als PCR bekannt, die Referenzmethode für die Diagnose von Covid-19. Obwohl diese Technik den Nachweis positiver Fälle bei sehr geringer Viruslast ermöglicht, gibt es zwei Engpässe, die die Nachweiszeiten und ihre Anwendbarkeit im großen Maßstab einschränken. Bei der ersten handelt es sich um die Reinigung viraler RNA aus menschlichen Proben, bei der zweiten um die Nukleinsäure-Amplifikationstechnik, bei der das virale RNA-Molekül in ein komplementäres DNA-Molekül umgewandelt werden muss, um mit der PCR-Technik selbst fortfahren zu können.

Jeder dieser Schritte erfordert spezifische Inkubationszeiten, was bedeutet, dass der gesamte Prozess etwa 2-4 Stunden dauert. Hinzu kommt der hohe Preis der Reagenzien, die in den verschiedenen Phasen der Reaktion verwendet werden.

Die Koordinatoren dieses Projekts, die CSIC-Forscher Mario Fernández Fraga und Juan Ramón Tejedor Vaquero vom Zentrum für Forschung in Nanomaterialien und Nanotechnologie (CINN - CSIC) und Agustín Fernández Fernández vom Institut für Gesundheitsforschung des Fürstentums Asturien (ISPA), erläutern: "Das Prinzip dieser Nachweismethode basiert auf der Verwendung von molekularen Leuchtfeuern. Diese "Sensoren" bestehen aus einer fluoreszenzemittierenden Region, die in ein DNA-Molekül integriert ist. Unter normalen Bedingungen ist dieses Signal abgeschaltet. Diese Beacons sind jedoch in der Lage, sich in Gegenwart der Zielnukleinsäure zu aktivieren und zu fluoreszieren, was den Nachweis von Virus-RNA in der Probe ermöglichen würde. Dabei handelt es sich um eine Methode, die auf einer bekannten Technik basiert, die bereits in mehreren Anwendungen eingesetzt wurde, darunter auch eine Modalität der PCR selbst.

"Zwei Methoden werden parallel entwickelt: Die erste würde sich auf eine gezielte Erfassung der viralen RNA durch den Einsatz von Nanopartikeln konzentrieren, was die Effizienz steigern und die für die Extraktion der RNA aus menschlichen Proben benötigte Zeit verkürzen würde", erklärt Fernandez Fraga.

"Die zweite Methodik würde sich auf den direkten Nachweis der viralen RNA selbst beziehen, der sich auf die Verwendung dieser molekularen Leuchtfeuer in Verbindung mit einem Fluoreszenzsignal-Amplifikationssystem konzentrieren würde, das unabhängig von der Verwendung von Polymerasen und der gesamten Batterie assoziierter Reagenzien arbeiten würde", fügt Tejedor Vaquero hinzu.

"Wenn all dies funktioniert, hätte diese Technologie eine hohe Skalierbarkeit und eine große Flexibilität, da sie sich an verschiedene Detektionsinstrumente anpassen könnte, entweder an quantitative PCR-Geräte oder an jedes Gerät, das mit einem Fluoreszenzsignal-Lesegerät ausgestattet ist, was die Anzahl der pro Tag verarbeiteten Proben erheblich erhöhen würde", prognostiziert Fernández Fraga.

"Da die Kosten für die Reagenzien, die für die Nukleinsäure-Amplifikation benötigt werden, nicht von der Methode abhängen, könnte diese Technik außerdem die Verarbeitungskosten pro Probe um etwa 50-70% reduzieren. Im Erfolgsfall würde diese Diagnosetechnik ein groß angelegtes Screening von Patienten mit Covid-19-Symptomen schnell, präzise und kostengünstig ermöglichen", sagt Fernández.

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