Reinigungstechniken für Antikörper sinnvoll verbinden

Das richtige Gleichgewicht zwischen Ausbeute und Reinheit

Lotta Hedkvist, Severine Lebarq, Axel Parbel

Die richtige Balance zwischen Ausbeute und Reinheit bei Antikörperreinigungen

Reinigungsprotokolle für Antikörper werden im Wesentlichen von zwei Faktoren beeinflusst:

  • So viele Antikörper wie möglich aus der Probe aufzufangen, ohne diese weiter zu schädigen
  • Verbliebene Verunreinigungen zu entfernen und den Anteil an aggregierten Antikörpern zu reduzieren

Wenn man diese Ziele im Fokus behält, was muss dann bei der Planung der Reinigungskonzepte für Antikörper berücksichtigt werden?

  • Die Auswahl der Reinigungstechniken hängt von der benötigten Reinheit des Antikörpers ab. Der benötigte Reinheitsgrad wird durch die nachfolgende Anwendung bestimmt und ist in der untenstehenden Tabelle zusammengefasst.
  • Vor dem Beginn sollten die Ziele sorgfältig definiert werden, und dabei gilt es zu berücksichtigen, dass jeder zusätzliche Schritt die Reinheit erhöht, jedoch gleichzeitig die Wiedergewinnung1 und Ausbeute2 reduziert

Typische Anwendung                                                 Reinheitsgrad

Massenspektrometrie, Immunisierung                             moderat bis hoch; 80% bis 90%

Funktions- und Strukturexperimente                                sehr hoch, 95% bis 99%

Strukturaufklärung, therapeutische Proteine                     höchst möglich, <99%

1Wiedergewinnung = Die relative Menge an Zielprotein (gemessen in %), die bei einem Reinigungsschritt gewonnen wird, im Vergleich zum auf die Säule aufgetragenen Ausgangsmaterial.

2Ausbeute = Menge an Zielprotein, das nach einem einzigen Reinigungsschritt oder nach dem gesamten Prozess gewonnen wurde

Wie sind Reinigungsprotokolle für Antikörper zusammengesetzt?

Die Abbildung beschreibt bewährte Beispiele für die Abfolge und Kombination von Reinigungsprotokollen bei Antikörpern.

Mögliche 1-, 2- oder 3-Schritt Protokolle für die Reinigung von Antikörpern unter Berücksichtigung der Zielsetzung - hohe Ausbeute, ausgewogene Ausbeute und Reinheit und höchste Reinheit.

Alle Protokolle beginnen typischerweise mit einer Affinitätschromatographie (AC). Dieser erlaubt die spezifische Gewinnung von Antikörpern aus dem Startmaterial (z.B. Serum oder Zellkultur).

1-Schritt oder 2-Schritt Protokolle

Ein Schritt und 2-Schritt Protokolle sind die empfohlene Wahl für Anwendungen in der Forschung. Nach dem Affinitätsschritt (AC) ist die Reinheit typischerweise bereits hoch (> 90%). Sollte es notwendig sein, entstandene Fragmente und Aggregate zu entfernen, um monomere Antikörper zu erhalten, ist die Größenausschlußchromatographie (SEC) die empfohlene Technik. Die Reinheit nach einer solchen zweistufigen Reinigung steigt dabei auf 95 bis 99 % und ist damit sehr hoch.

3-Stufiges Protokoll

Dreistufige Reinigungen sind besonders im Bereich Prozessentwicklung und für größere Mengen zu bevorzugen. Dabei wird im letzten Schritt keine SEC verwendet, um Aggregate oder Fragmente zu entfernen, bedingt durch die Einschränkungen bei der Probenmenge. Stattdessen wird eine Kombination aus Ionenaustauschchromatographieschritten (IEX) verwendet.

Nach dem AC Schritt wird zuerst eine Kationenaustauschchromatographie (CIEX) im sogenannten „Bindungs/Elutions“ Modus verwendet, wobei Proteine der Wirtszelle (HCP), Protein A Liganden, monoklonale Ab Aggregate und Fragmente und andere Isoformen entfernt werden.
Im Anschluss wird die Probe auf eine AIEX (Anionenaustauschchromatographie) Säule im „Durchfluss“ Modus für die endgültige Entfernung von verbliebenen Verunreinigungen, bestehend aus HCP, DNS und Viruspartikeln, gegeben. Die Reinheit des Antikörpers steigt dabei auf über 99% (sehr hoch).

Bedeutung von Pufferaustausch und Konzentrierungsschritten innerhalb der Protokolle

Damit die Probe während des Reinigungsschemas mit den Bedingungen des nächsten Schritts kompatibel bleibt, kann es notwendig sein, Entsalzungssäulen zum Pufferaustausch und/oder Konzentratoren zur Reduktion des Probenvolumens zu verwenden.

Welche Säulen sind für welchen Schritt am besten geeignet?

Affinitätsschritt:

  • HiTrap™ Protein A HP oder HiTrap Protein G HP
  • HiTrap MabSelect™ PrismA oder HiTrap MabSelect SuRe™
  • HiScreen™ MabSelect PrismA oder HiScreen MabSelect SuRe (for PD or scale-up)

Ionenaustauschschritt:

  • HiTrap Capto™ S ImpAct oder HiScreen Capto S ImpAct (CIEX)
  • HiTrap Capto Q oder HiScreen Capto Q (AIEX)

Größenausschlußschritt:

  • Superdex™ 200 Increase
  • HiLoad™ Superdex 200 pg
  • HiPrep™ Sephacryl™ S-300 HR

Zum Entsalzen bzw. Pufferaustausch verwendet man am besten HiTrap 5 mL oder HiPrep 26/10 Desalting Säulen für Probenvolumina bis zu 15 mL

Mehr Details über die beste Säulenwahl unter Berücksichtigung der Anwendung und Reinheitsanforderung sind zusammengestellt in der „Antikörper Reinigung und Nachweis“ Broschüre (29251059AC, Englisch) verfügbar auf gelifesciences.com.

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