Innovative Mixed-Mode Sorbentien und Membranen für die Prozesschromatographie

Neue Selektivitäten für die Proteinaufreinigung

Dr. Dirk Sievers
Pall GmbH, Life Sciences, BioPharmaceuticals, Philipp-Reis-Straße 6, D-63303 Dreieich

Dr. Sylvio Bengio
Pall BioSepra. Life Sciences, BioPharmaceuticals, 48 avenue des Genottes, F-95800 Cergy-Saint-Christophe

Die Fortschritte in der Biotechnologie haben die Anforderungen an pharmazeutische Produktionsprozesse spürbar verändert. Die in den vergangenen Jahren erzielten Leistungssteigerungen im Upstream-Bereich erfordern nun eine nachhaltige Optimierung der folgenden Aufreinigungsprozesse im Downstream-Bereich. Insbesondere im Hinblick auf die chromatographischen Aufreinigungsmethoden ist ein Bedarf für leistungsstärkere Techniken entstanden, die die traditionellen Verfahren der Ionenaustauschchromatographie, der Affinitätschromatographie oder der Hydrophoben Interaktionschromatographie ergänzen. Nachdem die Anzahl biotechnologisch hergestellter Arzneimittelkandidaten, die gegenwärtig in klinischen Studien untersucht werden, erheblich zugenommen hat, rücken die bislang in Kauf genommenen Schwachstellen dieser konventionellen Techniken zunehmend in den Vordergrund. Welche Alternativen oder Weiterentwicklungen gibt es?

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Aufreinigung biotechnologisch gewonnener Proteine im Downstream Processing.

Die Aufreinigung therapeutischer Proteine im Downstream Processing umfasst in der Regel eine Serie aufeinander folgender chromatographischer Arbeitsschritte, die sich grob in die Teilbereiche Capture, (Intermediate) Purification und Polishing aufteilen lassen (Abb. 1). Der initiale Capture Schritt verfolgt primär die Aufkonzentrierung des Zielproteins durch Abtrennung von Wasser als "Hauptverunreinigung". Darüber hinaus soll das Zielprotein in eine stabilisierende, proteasefreie Umgebung überführt werden. Somit ist neben einer hohen dynamischen Bindungskapazität des chromatographischen Mediums der Faktor Geschwindigkeit von großer Bedeutung. Der intermediäre Purification Schritt dient der eigentlichen Aufreinigung, sodass an dieser Stelle eine ausgezeichnete Auflösung selbst strukturell ähnlicher Verbindungen (z.B. Aggregate oder Missfaltungen) gewährleistet sein sollte. Der abschließende Polishing Schritt sorgt schließlich für den finalen Feinschliff, d.h. die Entfernung verbliebener Spurenverunreinigungen (DNA, Endotoxine, Viren, Wirtszellproteine). Das Zielprotein muss am Ende des Aufreinigungsprozesses in maximaler Ausbeute und höchster Reinheit vorliegen.

Status Quo in der Prozesschromatographie

Als chromatographische Aufreinigungstechniken haben sich insbesondere die Ionenaustauschchromatographie (IEX), die Affinitätschromatographie (AC) und die Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) etabliert. Sie bieten dem Anwender wichtige Leistungsvorteile, lassen aber dennoch Spielraum für Verbesserungen. Ihre bekannten Schwachstellen mögen bislang mehr oder weniger bereitwillig akzeptiert worden sein, doch erzwingen die stark gestiegenen Proteinausgangskonzentration (im Bereich von 10 g/l) und Zellkulturvolumina (im Bereich von 20.000 l) ein Umdenken. Außer diesen prozesstechnischen Überlegungen spielen wirtschaftliche Faktoren eine entscheidende Rolle. Der Anteil der Chromatographie an den Gesamtkosten biotechnologischer Prozesse (Upstream & Downstream) hat infolge der upstream-seitigen Fortschritte erheblich zugenommen. In den meisten Prozessen stellt ein Anteil von 40-60% eine realistische Größenordnung dar, sodass die Chromatographie neben der ebenfalls kostenintensiven Virusfiltration den größten finanziellen Aufwand erfordert. Die Entwicklung neuer Prozesse, die effizient und wirtschaftlich zugleich ausgelegt sein sollten, ist folglich eine der ganz großen Herausforderungen im biopharmazeutischen Umfeld.

Optimierungsmöglichkeiten

Die aufgeführten chromatographischen Aufreinigungsverfahren bieten dem Anwender viele wertvolle Handhabungsvorteile. Andererseits besteht eine Reihe kritischer Schwachstellen, deren Überwindung neue Perspektiven in der Prozessentwicklung und -führung eröffnen könnte:

  • Verzicht auf drastische pH-Werte zum Erhalt der biologischen Integrität der Zielproteine
  • Begrenzung der erforderlichen Feedstockverdünnung vor dem initialen Protein Capture
  • Auflösung von Proteinen mit ähnlichen Eigenschaften (Hydrophobizität & pI)
  • Senkung der Konzentration kritischer Salze (z.B. Ammoniumsulfat)
  • Vereinfachung der Regeneration (Kompatibilität mit 1 N NaOH)
  • Minimierung der Anzahl an Umpufferungsschritten
  • Senkung der Aufreinigungskosten

Diese Auflistung, die keinen Anspruch auf Vollständigkeit erhebt, darf als Wunschliste der biopharmazeutischen Industrie angesehen werden. Sie spricht alle bereits erwähnten Spielarten der Prozesschromatographie an.

IEX

Die Ionenaustauschchromatographie erfordert die sorgfältige Einstellung des Feedstocks hinsichtlich pH-Wert und Leitfähigkeit, sodass dieser nicht immer direkt aus dem Bioreaktor übernommen werden kann. Die Bindungskapazität würde in diesem Falle mit wenigen Milligramm pro Milliliter sehr gering ausfallen. In der Regel wird der pH-Wert im Bereich zwischen pH 3 und pH 5 eingestellt. Die Leitfähigkeit, die häufig zunächst bei 15-19 mS/cm liegt, wird üblicherweise auf 5-7 mS/cm gesenkt.

In der Praxis bedeutet dies oftmals eine Verdünnung des Feedstocks (Faktor 3-6). Mag dies im Labormaßstab akzeptabel sein, stellen Zellkulturvolumina von mehr als 10.000 Litern völlig andere Anforderungen. Alleine die erforderlichen Puffermengen brächten erhebliche Probleme hinsichtlich Kosten und Lagerung. Idealerweise sollte somit eine nur minimale (oder gar keine) Verdünnung erforderlich und dennoch eine hohe Kapazität und hohe Wiederfindung der Wertstoffe gewährleistet sein.

Die Ionenaustauschchromatographie kommt besonders dann an ihre Grenzen, wenn es gilt, Proteine mit ähnlichen isoelektrischen Punkten voneinander zu trennen. So wird es in der Regel nicht gelingen, unerwünschte Aggregate ohne einen zusätzlichen Chromatographieschritt sicher und vollständig zu entfernen.

AC

Die Affinitätschromatographie, die in ihrer kostenintensiven Protein A Variante zur Aufreinigung monoklonaler Antikörper sehr gebräuchlich ist, erfordert die Einstellung sehr saurer Elutionsbedingungen (pH < 3). Als Folge ergibt sich die Gefahr einer unerwünschten Aggregatbildung oder Denaturierung der Zielproteine. Hinzu kommt ein signifikantes Auswaschen der Liganden mit zunehmender Säulenlebensdauer, sodass sich Protein A in der Zielfraktion wiederfindet und später in einem Folgeschritt entfernt werden muss.

Protein A Sorbentien sind darüber hinaus nicht vollständig mit 1 N NaOH kompatibel, sodass zur Regeneration in der Regel mildere Bedingungen erforderlich sind. Diese ermöglichen eine akzeptable Lebensdauer des Sorbens, erhöhen andererseits aber das Risiko unerwünschter Kreuzkontaminationen.

HIC

Die Hydrophobe Interaktionschromatographie verlangt die anfängliche Zugabe großer Mengen anti-chaotroper Salze. Diese sorgen für eine Hydrophobisierung der Probe und sind eine wesentliche Voraussetzung für deren Retention durch die ebenfalls hydrophoben HIC Liganden (z.B. Octyl, Butyl, Phenyl). Anwendung findet oftmals Ammoniumsulfat in hohen Konzentrationen (bis 3 M). Im industriellen Maßstab mit Volumina von mehreren Tausend Litern bedeuten diese massiven Salzmengen einen Alptraum. Sie verursachen Säulenhardwareprobleme durch Korrosion und müssen später wieder aus der Zielfraktion entfernt werden. Somit entsteht zusätzlicher Arbeitsaufwand, der zudem weitere Kosten für das Recycling der ökologisch problematischen Ammoniumverbindungen nach sich zieht. Insbesondere diese Zusatzkosten stellen einen der großen Kritikpunkte an dieser Technologie dar.

Alle aufgeführten Aspekte verdeutlichen das Optimierungspotential der derzeit für die Prozesschromatographie gebräuchlichen Methoden. An genau dieser Stelle liegt das große Potential der Mixed-Mode Chromatographie.

Abbildung 2: Mixed-Mode Sorbentien der HyperCel Plattform zur effizienten und wirtschaftlichen Proteinaufreinigung: MEP HyperCel, HEA HyperCel und PPA HyperCel.

Mixed-Mode Sorbentien (Capture und Purification)

Der Begriff Mixed-Mode bezeichnet einen multiplen Retentionsmechanismus als Grundlage der Wechselwirkungen zwischen der Probe und dem Sorbens. Schon in den 1970er Jahren experimentierten findige Forscher an ihren Universitäten mit ausgefallenen Mixed-Mode Liganden, doch lagen im Prozessmaßstab kommerziell verfügbare Sorbentien damals noch in weiter Ferne. Mittlerweile hat sich das Bild verändert. Mixed-Mode Sorbentien haben massiven Zugang in die Prozessentwicklung für neue chromatographische Verfahren gefunden. Ein Beispiel ist die in den industriellen Maßstab skalierbare HyperCel Mixed-Mode Plattform zur Proteinaufreinigung. Sie umfasst die drei synthetischen Sorbentien MEP HyperCel, HEA HyperCel und PPA HyperCel, deren Liganden auf einer robusten Matrix verankert sind (Abb. 2). In der Praxis werden die Sorbentien bereits in Säulen mit einem Volumen von mehreren hundert Litern eingesetzt. Tabelle 1 fasst wichtige chemisch-physikalische Eigenschaften der HyperCel Mixed-Mode Sorbentien zusammen.

 

MEP HEA PPA
Ligand
4-Mercaptoethylpyridin Hexylamin Phenylpropylamin
pKa 4,8 8,0 8,0
Partikelgröße [µm] 90 90
90
Ligandendichte [µmol/ml] 80 70 70
Dyn. Bindungskapazität [mg/ml] > 20 mg/ml *
> 40 mg/ml **
> 40 mg/ml **
Tabelle 1: Chemisch-physikalische Eigenschaften der HyperCel Mixed-Mode Sorbentien.
* Bestimmung mittels 5 mg/ml Human IgG in PBS, Flussrate: 60 cm/h (10% Breakthrough).
** Bestimmung mittels 5 mg/ml BSA in PBS, Flussrate: 100 cm/h (10% Breakthrough).

Abbildung 3: a, MEP HyperCel (pKa 4,8) ist unter den empfohlenen Beladungsbedingungen (PBS, pH 7,4) nicht geladen. Die pH-Senkung bewirkt eine Ladungsinduktion auf dem Sorbens und eine Verstärkung der Proteinladung. b, HEA HyperCel und PPA HyperCel (pKa 8,0) sind bereits unter den empfohlenen Beladungsbedingungen positiv geladen. Die pH-Senkung bewirkt eine Verstärkung der Sorbens- und Proteinladung und somit die Elution des Proteins.

Retention unter physiologischen Bedingungen

Der HyperCel Mixed-Mode Retentionsmechanismus basiert primär auf hydrophoben Wechselwirkungen unter neutralen ("physiologischen") Bedingungen (PBS, pH 7,4). Die Zugabe von Ammoniumsulfat oder anderer anti-chaotroper Salze in hoher Konzentration, die seitens der ebenfalls auf hydrophoben Wechselwirkungen basierenden Hydrophoben Interaktionschromatographie unabdingbar ist, entfällt. Die Elution erfolgt nach moderater pH-Senkung im Sinne eines Stufengradienten durch elektrostatische Abstoßung gleicher (positiver) Ladungen. In der Regel reichen pH-Werte der mobilen Phase zwischen pH 4,5 und pH 4,0 aus. Stärker saure Bedingungen sind nicht erforderlich.

MEP HyperCel ist unter Beladungsbedingungen nicht geladen, während die Proteine (partiell) positiv geladen vorliegen. Die pH-Senkung bewirkt eine Ladungsinduktion durch Protonierung des Pyridinrings der Liganden und eine Verstärkung der Proteinladung. (Dieser Sonderfall wird auch als Hydrophobic Charge Induction Chromatography (HCIC) bezeichnet.) HEA HyperCel und PPA HyperCel sind dagegen bereits unter Beladungsbedingungen (partiell) positiv geladen, sodass die pH-Senkung eine Verstärkung der positiven Sorbens- und Proteinladung bewirkt. Als Folge ergibt sich die angesprochene elektrostatische Abstoßung gleicher (positiver) Ladungen. Sobald diese die hydrophoben Wechselwirkungen in ihrer Stärke übertrifft, löst sich die Probe von der Säule (Abb. 3).

Abbildung 3: a, MEP HyperCel (pKa 4,8) ist unter den empfohlenen Beladungsbedingungen (PBS, pH 7,4) nicht geladen. Die pH-Senkung bewirkt eine Ladungsinduktion auf dem Sorbens und eine Verstärkung der Proteinladung. b, HEA HyperCel und PPA HyperCel (pKa 8,0) sind bereits unter den empfohlenen Beladungsbedingungen positiv geladen. Die pH-Senkung bewirkt eine Verstärkung der Sorbens- und Proteinladung und somit die Elution des Proteins.

Die Aufreinigung stark basischer Proteine, die unter Standardbeladungsbedingungen (pH 7,4) bereits eine signifikante positive Ladung tragen, erfordert die Einstellung basischerer Bedingungen zur Probenaufgabe. In der Praxis empfiehlt sich dann die Einstellung eines höheren pH-Werts von etwa pH 8. Die Elution erfolgt weiterhin durch pH-Senkung im Zuge eines Stufengradienten. Somit bleibt der pH-Wert der mobilen Phase der entscheidende Parameter, das wichtige "Schräubchen zum Drehen". Das einheitliche Funktionsprinzip der HyperCel Plattform bedeutet eine wichtige Vereinfachung in der frühen Methodenentwicklung.

Abbildung 4: Steuerung der Elution auf HyperCel Mixed-Mode Sorbentien durch Senkung des pH-Werts.

Elutionsfolge

Als Faustregel lässt sich festhalten, dass basische Proteine infolge ihrer Struktur vor sauren Proteinen eluieren: je höher der isoelektrische Punkt, desto früher die Elution. Darüber hinaus eluieren hydrophilere Proteine vor hydrophoberen. In der Praxis lassen sich die Zielproteine somit nach basischeren und hydrophileren Kontaminanten von der Säule lösen, während saurere und hydrophobere Verunreinigungen weiter auf dem Sorbens verbleiben. Sie lassen sich in der Regenerationsphase bequem entfernen. Aggregate, die generell hydrophober als das entsprechende Monomer sind, lassen sich sicher abtrennen. Sie eluieren infolge der stärkeren Wechselwirkung mit dem Sorbens zeitlich nach dem monomeren Zielprotein (Abb. 4).

Abbildung 5: Anwendungsbereiche der HyperCel Mixed-Mode Sorbentien mit typischen Arbeitsbedingungen

Die HyperCel Mixed-Mode Plattform bietet neue Selektivitäten zur Proteinaufreinigung (orthogonal zu IEX & HIC) und eignet sich insbesondere zur Aufreinigung monoklonaler Antikörper sowie anderer rekombinanter Proteine und Enzyme (Abb. 5).

 

 

HIC in Gegenwart moderater Salzmengen

Alle drei HyperCel Mixed-Mode Sorbentien eignen sich als Alternative zur klassischen Hydrophoben Interaktionschromatographie für die Aufreinigung rekombinanter Proteine und Enzyme bei gleichzeitiger Abreicherung von DNA und Endotoxinen. Sie sind deutlich hydrophober als die meisten anderen zur Proteinaufreinigung verfügbaren hydrophoben Sorbentien, sodass ein hydrophober Interaktionsmechanismus bereits in Abwesenheit größerer Salzmengen unter neutralen Bedingungen erreicht werden kann. Die Bindungskapazitäten klassischer HIC Sorbentien sind dagegen unter diesen "physiologischen" Bedingungen vernachlässigbar gering.

Die Zugabe HIC typischer Salze in hohen Konzentrationen kann allerdings, falls notwendig, zur Retentionsverstärkung eingesetzt werden. Alle HyperCel Mixed-Mode Sorbentien sind mit anti-chaotropen Salzen wie Ammoniumsulfat vollständig kompatibel. Im Falle einer nicht befriedigenden Bindungskapazität ließe sich somit eine Optimierung des Retentionsverhaltens durch Zugabe geringer Salzmengen erreichen. So können Proteine nach Zugabe anti-chaotroper Salze sogar unterhalb ihres isoelektrischen Punkts (pI) gebunden werden. Die Elution erfolgt in diesem Fall durch Senkung der Salzkonzentration. Die hierfür sinnvollen Salzausgangskonzentrationen (0,5-1 M) liegen deutlich unter denen für die klassische Hydrophobe Interaktionschromatographie (bis 3 M).

Abbildung 6: Temperaturabhängigkeit der Bindungskapazität der HyperCel Mixed-Mode Sorbentien.

Die Ligandendichte der HyperCel Mixed-Mode Sorbentien ist auf maximale dynamische Bindungskapazität optimiert. Aus vermutlich sterischen Gründen ergäbe eine weitere Erhöhung der Ligandendichte keine weitere Steigerung dieses Parameters. Analog zur Hydrophoben Interaktionschromatographie, die auch als entropiegetriebene Chromatographie bezeichnet wird, erhöht sich die dynamische Bindungskapazität im Falle der HyperCel Mixed-Mode Sorbentien mit steigender Temperatur. Aus Anwendersicht bedeutet dies, dass eine Temperaturkontrolle von großer Bedeutung ist (Abb. 6).

 

Die generell milderen chromatographischen Bedingungen gewährleisten in der Praxis einen hohen Erhalt der biologischen Funktionalität der Zielproteine. Der spezifische Mixed-Mode Mechanismus macht es möglich, Aggregate, Missfaltungen und Kontaminanten in einem Schritt abzutrennen. Das Zielprotein wird in verdünnter Pufferlösung mit moderater Leitfähigkeit (z.B. 50 mM Natriumcitrat, pH 4) gewonnen. Darüber hinaus ergeben sich Vorteile ökologischer und ökonomischer Art.

Protein A Alternative zum günstigen Preis

Monoklonale Antikörper (Mabs) repräsentieren derzeit etwa 35% aller sich in klinischen Studien befindlichen Proteine. Die chromatographische Aufreinigung erfolgt bevorzugt mittels Protein A Affinitätschromatographie. Ein wesentlicher Nachteil der Verwendung dieses Liganden ist allerdings der sehr hohe Preis von 8.000-12.000 Euro pro Liter Sorbens. Protein A Sorbentien sind damit ein wesentlicher Kostenfaktor, den die Industrie gerne senken möchte.

MEP HyperCel eignet sich mit seinen maßgeschneiderten 4-Mercaptoethylpyridin-Liganden als Alternative zur Protein A Chemie. Die Liganden enthalten mit ihrem heterozyklischen Pyridinring und der Thioetherstruktur Elemente, die in dieser Kombination eine hohe Antikörper-Affinität aufweisen. MEP HyperCel lässt sich zur Aufreinigung verschiedenster Spezies und Subklassen monoklonaler Antikörper einsetzen. Die Bindungskapazitäten entsprechen in etwa denen gängiger Protein A Sorbentien.

Neben den geringeren Kosten ergeben sich weitere wichtige Anwendungsvorteile. Die Elution erfordert vergleichsweise milde pH-Werte. Sie erfolgt auf MEP HyperCel in der Regel im Bereich um pH 4,5 bis pH 4,0, während die Elution auf Protein A Sorbentien typischerweise die angesprochene Senkung auf Werte von pH 3,0 (oder geringer) erfordert. Mildere Elutionsbedingungen sind insbesondere für die große Gruppe von Antikörpern von elementarer Bedeutung, die bereits ab pH 4 zu Aggregatbildung und Ausfällung neigen.

MEP HyperCel ist darüber hinaus gegenüber harschen Regenerationsbedingungen (1 N NaOH) resistent (200 CIP Zyklen), woraus unmittelbar eine höhere Lebensdauer und eine nochmalige Steigerung der Wirtschaftlichkeit folgt. In Verbindung mit den erheblich niedrigeren Sorbenskosten ergibt sich somit in der Summe ein signifikanter Preisvorteil.

Abbildung 7: PRC Fertigsäulen zum effizienten und schnellen Selektivitätsscreening in der Chromatographie.

Fertigsäulen zum Selektivitätsscreening

Die effiziente Gestaltung leistungsstarker chromatographischer Aufreinigungsverfahren im Downstream-Bereich biotechnologischer Produktionsprozesse setzt ein schnelles und verlässliches Screening potentiell geeigneter Sorbentien im Entwicklungsmaßstab voraus. Aus diesem Grund sind alle HyperCel Mixed-Mode Sorbentien in PRC Fertigsäulen für den Labormaßstab verfügbar (Abb. 7). Die aus Polypropylen gefertigten Chromatographiesäulen (Dimension: 5 x 50 mm, Säulenvolumen: 1 ml) sind zudem als druckstabile Ceramic HyperD ("Gel-in-a-Shell") Ionenaustauscher verfügbar. Sie eignen sich beispielsweise zur Aufreinigung monoklonaler und polyklonaler Antikörper, rekombinanter Proteine, Enzyme, Plasmide oder Vakzine. Alle PRC Säulen, die sich durch hohe Bodenzahlen auszeichnen, können an jedes handelsübliche Chromatographiesystem angeschlossen werden. Sie stellen eine hervorragende Grundlage für die spätere Aufskalierung dar, da sich alle verfügbaren Sorbentien im Labor-, Pilot- und Produktionsmaßstab nutzen lassen.

Abbildung 8: LRC Leersäulen mit unterschiedlichen Innendurchmessern (10 mm, 15 mm, 25 mm und 50 mm) und Zylinderlängen (Betthöhen bis 750 mm, Säulenvolumina bis 900 ml).

Die Säulen ergänzen die Familie der LRC Leersäulen, die mit unterschiedlichen Innendurchmessern (10 mm, 15 mm, 25 mm und 50 mm) und Zylinderlängen (bis 750 mm Betthöhe) erhältlich sind (Abb. 8). Die aus Borsilikatglas gefertigten Säulen halten Drücken von bis zu 30 bar stand. Sie verfügen über ein anwenderfreundliches "Screw-Lock-System" mit einlassseitig beweglichem Kunststoffkolben, der die Einstellung von Betthöhen bis 750 mm und damit verbundenen Säulenvolumina bis 900 ml ermöglicht. Auch die Leersäulen sind mit allen handelsüblichen Chromatographiesystemen kompatibel.

 

Polishing mit Membranadsorbern

Machen die neuen Mixed-Mode Sorbentien die Durchführung eines finalen Polishing Schritts im Downstream Processing überflüssig? Eher nein. Sie tragen zwar zu einer erheblichen Senkung der Konzentrationen unerwünschter Spurenverunreinigungen (DNA, Endotoxine, Viren, Wirtszellproteine) bei, doch wird deren sichere Entfernung in der Regel auch weiterhin einem separaten Chromatographieschritt vorbehalten bleiben. Dieser darf allerdings keinen zeitlichen Engpass verursachen, sodass der Faktor Geschwindigkeit für das Polishing einen sehr wichtigen Aspekt darstellt. An dieser Stelle liegt das große Potential der Membranchromatographie.

Eine erfolgreiche chromatographische Aufreinigung erfordert generell eine gute Zugänglichkeit der porösen Matrix. In ihr befindet sich der größte Teil der Oberfläche und somit der Liganden, die für die Wechselwirkungen mit der Probe von entscheidender Bedeutung sind. Können Moleküle infolge ihrer Größe oder infolge zu hoher Flussraten nicht in diese Poren eindringen, liefert die chromatographische Trennung keine befriedigenden Ergebnisse. Die offenporigere Struktur von Membranen (~ 8000 Ǻ) gegenüber der von Sorbentien (~ 1000 Ǻ) ermöglicht somit eine effiziente Retention auch größerer Makromoleküle bei höheren Flussraten. Der Anwender profitiert von sehr hohen dynamischen Bindungskapazitäten und erfreut sich zudem an einem gegenüber klassischen Sorbentien geringeren Kostenaufwand. Die größere Dimension einer klassischen Säule für vergleichbare Geschwindigkeiten würde erhebliche Mehrkosten verursachen, die aus chromatographischer Sicht weder notwendig noch vertretbar sind.

Abbildung 9: Mustang XT 5000 Membranadsorberkapsule zur Verwendung im Proteincapture (Membranvolumenmaximierung durch serielle Kombination mehrerer Kapsulen).

Die Überlegung, den Polishing Schritt im Flow Through Modus durchzuführen, ergibt sich aus der Tatsache, dass das Zielprotein bereits in hoher Konzentration und Reinheit vorliegt. In diesem Modus werden nur die abzutrennenden Spurenverunreinigungen retardiert, während das Zielprotein nicht zurückgehalten wird. Die Verunreinigungen tragen unter Prozessbedingungen allesamt negative Ladungen, sodass in der Regel Anionenaustauscher (Q Modifikation) eingesetzt werden. Sie lassen sich als Single Use Kapsulen nach Gebrauch bequem mitsamt der Verunreinigungen entsorgen. Da keine Reinigung (und Reinigungsvalidierung) erforderlich ist, liegt hier zudem ein signifikantes Kostensenkungspotential.

 

Auch der initiale Capture Schritt kann unter dem Aspekt der Geschwindigkeit gesehen werden. Somit kann die Membranchromatographie auch an dieser Stelle wertvolle Dienste leisten. Eine Voraussetzung ist jedoch eine ausreichende Kapazität der verwendeten Membranen. So lässt sich der derzeit größte kommerziell verfügbare Membranadsorber (Abb. 9), der über ein Membranvolumen von fünf Litern verfügt, zur Aufarbeitung kleinerer bis mittlerer Prozessvolumina auch im Proteincapture verwenden. Die Membranchromatographie stellt somit ein wichtiges Werkzeug im Downstream Processing dar (Abb. 10).

Abbildung 10: Anwendungsbereiche der Membranchromatogaphie zur Proteinaufreinigung im Downstream Processing.

Zusammenfassung

Die Entwicklung innovativer Mixed-Mode Sorbentien und Membranen für die moderne Prozesschromatographie bedeutet für den Anwender wesentliche Leistungsvorteile. So bietet die Familie der HyperCel Mixed-Mode Sorbentien neue Selektivitäten zum Proteincapture und der Abtrennung unerwünschter Kontaminanten aus unverdünnten Feedstreams. Der multiple Retentionsmechanismus erlaubt die Abtrennung der Zielproteine von Aggregaten, Missfaltungen und Kontaminanten. Sie erfolgt auf der Basis von Hydrophobizitäts- und pI-Unterschieden, sodass auch komplexere Aufreinigungen bewältigt werden können. Alle HyperCel Sorbentien lassen sich als leistungsstarke Alternative zur Hydrophoben Interaktionschromatographe in Abwesenheit hoher Salzkonzentrationen einsetzen. Darüber hinaus eignet sich MEP HyperCel als Protein A Alternative zur kosteneffizienten Aufreinigung monoklonaler Antikörper. Die neuen Mixed-Mode Sorbentien können die notwendige Anzahl an chromatographischen Aufreinigungsschritten im Prozess verringern, während die ergänzende Anwendung der Membranchromatographie den finalen Polishing Schritt zur Abtrennung von Spurenverunreinigungen beschleunigt und vereinfacht. Die biopharmazeutische Produktion erhält damit neue Werkzeuge zur effizienten und wirtschaftlichen Proteinaufreinigung im Prozessmaßstab.

Fakten, Hintergründe, Dossiers
  • Korrosion
  • Ionenaustauscher
  • flow
Mehr über Pall
Ihr Bowser ist nicht aktuell. Microsoft Internet Explorer 6.0 unterstützt einige Funktionen auf Chemie.DE nicht.