GPC/SEC - Mit drei Augen sieht man mehr!

Größenausschlusschromatographie mit Dreifachdetektion im Vergleich zu reiner Brechungsindexdetektion

G. Heinzmann, B. Tartsch
Viscotek GmbH

Betrachtet man die weltweit installierten GPC-Systeme und welche Detektoren dabei eingesetzt werden, so wird man feststellen, dass bei der überwiegenden Mehrheit der Systeme ein Brechungsindexdetektor als alleiniger Detektor eingesetzt wird.

Andere Anwender haben als zusätzliche Detektoren ein Differentialviskosimeter und einen Rayleigh-Lichtstreudetektor an ihr GPC-System gekoppelt und dieses somit zu einem Dreifachdetektionssystem ausgebaut.

In diesem Artikel soll erörtert werden, in welchen Fällen der Einsatz eines Basis GPC-Systems mit reiner RI-Detektion sinnvoll ist und welche zusätzlichen Informationen man durch den Einsatz von zwei weiteren Augen erhält.

Einleitung

Der Brechungsindexdetektor (RI = Refractive Index Detector) ist der am weitesten verbreitete Detektor in der Gelpermeationschromatographie (GPC), auch als Größenausschlusschroma¬tographie (SEC = Size Exclusion Chromatography) bezeichnet. Bei dem RI-Detektor handelt es sich um einen so genannten Konzentrationsdetektor, da dieser das Konzentrationsprofil der Probe aufzeichnet. Anschließend kann man das Konzentrationsprofil gegen Standards mit bekannten Molekulargewicht und linearer Struktur vergleichen. Dieses als konventionelle Kalibrierung bezeichnete Prinzip ist in Abbildung 1 grafisch dargestellt. Engverteilte Polymerstandards mit bekanntem Molekulargewicht werden dabei vermessen und daraus eine Kalibrierkurve erstellt (oben). Die Probe wird in einzelne Integrationsschritte zerlegt und das jeweilige Molekulargewicht dafür aus der Kalibrierkurve ermittelt (unten). Durch entsprechende Aufsummierung erhält man die Molekulargewichtsmittelwerte und die Polydispersität Mw/Mn der Probe.

Nur wenn Probe und Kalibrierstandards aus demselben Material bestehen und dieselbe Struktur aufweisen, können mit der GPC/SEC mit Brechungsindexdetektion auf diese Weise absolute, also real vorliegende, Molekulargewichte gemessen werden. In allen anderen Fällen erhält man ein relatives Molekulargewicht bezogen auf die Kalibrierstandards.

Abb. 1: Konventionelle Kalibrierung.

Ein Beispiel hierfür ist die Analyse von linearem Polystyrol. Es gibt sehr genau charakterisierte, eng verteilte, lineare Polystyrolstandards. Erstellt man mit diesen Standards eine Kalibrierkurve so kann man das absolute Molekulargewicht von ebenfalls linearen Polystyrolproben bestimmen.

Die konventionelle GPC wird daher bevorzugt eingesetzt, wenn entsprechende Kalibrierstandards mit derselben Struktur vorhanden sind, relative Molekulargewichte ausreichend sind oder das Chromatogramm gleichartiger Proben lediglich miteinander verglichen werden soll. Vorteilhaft ist der einfache Aufbau eines solchen Systems was sich sowohl in der Investitionssumme als auch in der Bedienung bemerkbar macht.

Sind diese sehr engen Vorgaben jedoch nicht gegeben und man möchte das reale Molekulargewicht einer Probe bestimmen oder Informationen über die Verzweigungsstruktur und die Copolymerzusammensetzung gewinnen, so ist dies mit dem RI-Detektor alleine nicht möglich. Viscotek bietet daher seit vielen Jahren zusätzlich zu den Basis-Systemen mit reiner Brechungsindexdetektion die so genannte Dreifachdetektion (engl. Triple Detection) für die GPC an. Damit erhält man ein genaues Bild der zu untersuchenden Makromoleküle.

Unter Triple Detection oder Dreifachdetektion in der GPC versteht man die Kombination eines Rayleigh-Lichtstreudetektors mit einem Viskositätsdetektor und einem Konzentrationsdetektor, in der Regel ein Brechungsindexdetektor. Für die Analyse von Copolymeren kann ggf. noch ein UV-Detektor hinzugezogen werden. Dann würde man von Vierfachdetektion oder Tetra Detection sprechen.

Der Rayleigh-Lichtstreudetektor ist ein massensensitiver Detektor, welcher das Molekulargewicht der Probe an jedem Punkt im Chromatogramm misst. Er ist in der Lage, das absolute Molekulargewicht der Probe unabhängig von chemischer Struktur oder Form der Probe in Lösung zu bestimmen. Die Kleinwinkellichtstreuung bei einem Streuwinkel von 7° hat sich hier besonders bewährt, da die Auswertung der Ergebnisse dadurch sehr einfach wird und keine Extrapolation der Daten notwendig ist.
Der Differential Viskositätsdetektor besteht im Wesentlichen aus vier gleichartigen Kapillaren, die äquivalent einer Wheatstone’schen Brücke angeordnet sind. Zwei Druckaufnehmer erfassen darin die Druckverhältnisse. Als Ergebnis erhält man direkt die intrinsische Viskosität. Diese ist umgekehrt proportional zur Dichte des Makromoleküls in Lösung. Daher lässt sich mit Hilfe dieses Dichtedetektors einerseits der hydrodynamische Radius der Probe in Lösung und andererseits die Verzweigungsstruktur ermitteln.

Die Dreifachdetektion kombiniert folglich einen Konzentrationsdetektor mit einem Molekulargewichtsdetektor und einem Dichtedetektor. Jeder Detektor bildet hierbei quasi ein Auge, wobei jeder Detektor komplementäre Informationen zu einem Gesamtbild beiträgt.

Moderne, leistungsfähige Dreifachdetektionssysteme zeichnen sich durch eine optimale Abstimmung der Detektoren aufeinander und eine integrierte Bauweise aus. Es ist sehr wichtig, dass alle Detektoren nahe beieinander und möglichst in einem sehr exakt definierten Temperaturfeld sind. Nur dann können störende Effekte wie Totvolumina und Temperaturunterschiede minimiert werden. Brechungsindex- und Lichtstreudetektor sollten mit Licht der gleichen Wellenlänge arbeiten, da die Signale beider Detektoren auf das wellenlängenabhängige Brechungsindexinkrement dn/dc ansprechen. Weiterhin sollten alle Detektoren in Serie geschaltet sein. Durch Parallelschaltung von Detektoren verliert man zwangsläufig an Sensitivität.

Weitere Detektoren wie der Verdampfungslichtstreudetektor (ELSD = Evaporative Light Scattering Detector,), Fluoreszenz- oder Chrialitätsdetektoren finden bei speziellen Anwendungen ihren Einsatz. Der ELSD darf hierbei nicht mit den Rayleigh-Lichtstreudetektoren verwechselt werden, da der ELSD neben dem Konzentrationsprofil keinerlei zusätzlichen Informationen liefert.

Im Folgenden soll anhand einiger Beispiele aus der Praxis der Wert der Dreifachdetektion im Vergleich zur einfachen Brechungsindexdetektion dargestellt werden.

Lineare Proben und verzweigte Proben

Nur wenn Probe und Kalibrierstandards aus demselben Material bestehen und dieselbe Struktur aufweisen, können mit der GPC/SEC mit Brechungsindexdetektion absolute Molekulargewichte gemessen werden. Sobald sich die Proben aber strukturell von den Standards unterscheiden, werden die Resultate fehlerhaft. Eine verzweigte Probe hat bei gleichem Molekulargewicht immer einen kleineren hydrodynamischen Radius in Lösung als eine lineare Probe. Sie wird daher zu einem späteren Zeitpunkt von der Trennsäule eluieren und somit ein geringeres Molekulargewicht vortäuschen. Nur mit einem RI-Detektor kann man nicht erkennen, ob eine Probe, die später eluiert, nun ein geringeres Molekulargewicht aufweist oder aber aufgrund von Verzweigungen eine kompaktere Struktur besitzt. Diese Fragestellung kann mit der Dreifachdetektion beantwortet werden: der Lichtstreudetektor misst das Molekulargewicht der Probe und der Viskositätsdetektor die intrinsische Viskosität, die in reziproker Relation zur Dichte des Makromoleküls in Lösung steht. Somit kann schnell geklärt werden, ob ein Molekül, welches später eluiert, verzweigt ist oder eben doch nur bei linearer Struktur ein geringeres Molekulargewicht aufweist.

Abb. 2: Vergleich der Mark-Houwink-Diagramme (Log Intrinsische Viskosität über Log Molekulargewicht) einer linearen Polymerprobe mit einer verzweigten Polymerprobe

Ein Beispiel für die Analyse einer verzweigten Probe mit der GPC/SEC mit Dreifachdetektion zeigt Abbildung 2. Deutlich ist zu sehen, wie die dichtere Struktur der verzweigten Probe zu einer Abnahme der intrinsischen Viskosität bei gleichem Molekulargewicht führt.

Die lineare Probe hat ein mittleres Molekulargewicht (Mw) von 250.000 D. Mit einer reinen Brechungsindexdetektion würde man für die verzweigte Probe ein nahezu identisches aber falsches mittleres Molekulargewicht von 260.000 D erhalten. Das real vorliegende Molekulargewicht sowie die verzweigte Struktur der Probe kann mit der Dreifachdetektion ermittelt werden; es liegt bei 340.000 D. Der Brechungsindexdetektor kann die durch die Verzweigungen verursachte Massenzunahme (höhere molekulare Dichte) nicht erkennen.

Abb. 3: GPC/SEC-Analyse einer Polysaccharid-Probe mit schlecht gelösten Anteilen.

Biopolymere/Polysaccharide

Im Bereich der Biopolymere oder Polysaccharide ist die konventionelle GPC/SEC mit reiner Brechungsindexdetektion nur noch sehr begrenzt einsetzbar, da sich diese meist aus natürlichen Quellen stammenden Stoffe in ihrer Struktur stark unterscheiden. Die Spanne reicht von hoch verzweigten Stärkemolekülen bis hin zu sehr kettensteifen, offenen Hyaluronsäureproben. Als Kalibrationsstandards stehen im Wesentlichen verzweigte Dextrane und lineare Pullulane zur Verfügung. Aber bereits bei den Dextranen sind die Verzweigungen willkürlich angeordnet, so dass nicht einmal zwei Dextranproben mit gleichem Molekulargewicht unbedingt an derselben Stelle eluieren müssen. Für diese Art von Proben eignet sich die Dreifachdetektion in zweifacher Hinsicht sehr gut: zum einen können damit zuverlässig die absoluten Molekulargewichte der Proben und auch deren Verzweigungsstruktur bestimmt werden, zum anderen kann vor allem der Lichtstreudetektor oft schlecht gelöste Probenanteile erkennen, die bei einer reinen Brechungsindexdetektion nicht zu sehen sind, da ihre Konzentration zu gering ist (Abb. 3). Der kleine Prepeak im Brechungsindexdetektor zeigt an, dass hier ein kleiner Teil der Probe eluiert. Aus den großen Signalen der Lichtstreuung ist sofort zu erkennen, dass hier sehr hohe Molekulargewichte vorliegen. Aufgrund der geringen Viskosität liegt eine dichte Struktur vor, allerdings ist diese wie bei einem Microgel etwas durchspült, da die Viskosität nicht Null ist.

Abb. 4: Verschleppung bzw. Absorption von hochmolekularen Probenanteilen. Rot: RI-Chromatogramm / Schwarz: log M gegen Retentionsvolumen.

Weiterhin kann der Lichtstreudetektor auch Probenanteile erkennen die mit dem Material der Trennsäule wechselwirken und daher verspätet eluieren (Abb. 4). Typischerweise sind dies sehr hochmolekulare Bestandteile, was dazu führt, dass die Kurve log MW über Retentionsvolumen hin zu hohem Elutionsvolumen abflacht oder wie hier gezeigt im Extremfall sogar wieder ansteigt.

 

Proteine

Im Bereich der Proteine ist ein sinnvoller Einsatz der GPC/SEC mit reiner Brechungsindexdetektion oder UV-Detektion weiter eingeschränkt. Einerseits gibt es nicht genügend gut charakterisierte Proteinstandards, um eine gute Kalibrierkurve erstellen zu können, weiterhin ist eine starke Wechselwirkung zwischen Probe und Säulenmaterial eher die Regel als die Ausnahme, so dass die Retentionszeiten der Proteinproben nicht reproduzierbar sind. Hinzu kommt die Strukturvielfalt der Proteine durch die Sekundär- und Tertiärstruktur, welche einen enormen Einfluss auf die Größe des Proteins haben kann. Daher ist die Lichtstreuung zwingend notwendig, wenn man für die Proteine zuverlässige Molekulargewichte bestimmen möchte. Die Viskositätsdetektion kann Aufschlüsse über die Struktur bzw. über die Konformation und den hydrodynamischen Radius der Proteine geben.

Abb. 5: GPC/SEC-Analyse einer BSA-Probe mit Aggregationen. Rot: RI-Chromatogramm / Blau: Viskositätschromatogramm / Grün: Lichtstreuchromatogramm.

Im Proteinbereich ist oft weniger das genaue Molekulargewicht einer Probe von Interesse; dies wird meist über massenspektrometrische Methoden bestimmt oder ist über die Aminosäurensequenz bekannt. Vielmehr ist von Interesse, ob die Proteinmoleküle in Lösung als Monomere vorliegen oder Aggregate bilden (Dimere, Trimere, …). Diese Fragestellung kann die Massenspektrometrie in aller Regel nicht beantworten, da die Aggregate zu instabil für eine Analyse sind. Ein Beispiel für eine Proteinprobe mit Aggregationen zeigt Abbildung 5.

Der sehr komplexe strukturelle Aufbau von Proteinen kann auch zu völlig falschen Resultaten führen, wenn das Molekulargewicht nur über eine relative Messung bestimmt wird. Abbildung 6 zeigt die Analyse von zwei strukturell verschiedenen Proteinen. Das Protein Nr. 2 mit dem höheren Molekulargewicht eluiert später, da es eine sehr viel kompaktere Konformation als Protein Nr. 1 besitzt.

Abb. 6: GPC/SEC-Analyse von zwei strukturell verschiedenen Proteinen; das Protein mit dem höheren Molekulargewicht eluiert später.

Würde man die Molekulargewichte der beiden Proteine rein über das Elutionsvolumen bestimmen, würde für Protein 1 ein deutlich höheres Molekulargewicht resultieren als für Protein 2, was in keinster Weise der Wirklichkeit entspricht

Eine weitere interessante Messung, die nur mit Lichtstreudetektion durchgeführt werden kann, ist in Abbildung 7 aufgezeigt. Es handelt sich um die Messung von Proteasom 20 S, einem Molekül mit einem Hohlraum im Innern. Einmal ist der Hohlraum leer und einmal ist er gefüllt mit Cytochrom C Molekülen. Im Brechungsindex-Chromatogramm ist dieser Unterschied nicht zu erkennen, da sich sie Molekülgröße durch das Befüllen des Hohlraumes nicht ändert. Der Lichtstreudetektor kann aber die absolute Masse des Moleküls bestimmen. Ungefüllt ergibt sich eine Masse von 695.000 D, gefüllt resultieren 791.000 D. Berücksichtigt man die Masse von Cytochrom-C (12.000 D), so kann man leicht ausrechnen dass sich 8 Cytochrom-C Moleküle im Hohlraum des Proteasom 20S Moleküls befinden.

Abb. 7: Brechungsindexchromatogramme von einem mit Cytochrom C gefüllten und einem leeren Proteasom 20S Molekül.

Zusammenfassung

Anhand verschiedener Beispiele aus den Bereichen synthetische Polymere, Biopolymere und Proteine konnten die Grenzen der relativen oder konventionellen GPC/SEC mit reiner Brechungsindexdetektion aufgezeigt werden. Sobald strukturelle Unterschiede zwischen Probe und Standard vorhanden sind, werden die Ergebnisse der konventionellen GPC/SEC fehlerhaft. Die GPC/SEC mit Dreifachdetektion (Lichtstreuung, Viskositätsdetektion und Konzentrationsdetektion) kann diese strukturellen Unterschiede erkennen und somit absolute, also real vorliegende Molekulargewichte bestimmen. Weiterhin können Aggregate erkannt werden, die der Brechungsindexdetektor aufgrund der oft sehr geringen Konzentration nicht mehr detektieren kann. Mit der Technik der GPC/SEC mit Dreifachdetektion kann ein Polymer- Biopolymer oder Proteinmolekül daher sehr viel exakter charakterisiert werden, als dies mit einer reinen Brechungsindexdetektion möglich ist.

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