Neue Säulentechnologie in der Flüssigchromatographie

Applikation 1

Schnelle Methodenentwicklung und Upscaling am Beispiel eines Wurzelextraktes. Rotorvolumen 200 ml, Fluss 10 ml/min, Detektion: UV 254 nm
Lösungsmittelsystem: Hexan-Ethylacetat-Methanol-Wasser

full-screen	Abb. 1
Abb. 1	Abb. 2
	Abb. 3
Abb. 3	Abb. 4

Das analytische HPLC-Chromatogramm (Abb. 1) verdeutlicht die normale Komplexität eines solchen Rohextraktes. Der ursprüngliche Anteil der Zielkomponente von 6% wurde durch Anreicherung auf 25% gesteigert. Der angereicherte Extrakt enthält aber noch viele Verunreinigungen (Abb. 2). Nach Wahl eines geeigneten Lösungsmittelsystems werden 5 g des filtrierten Rohextraktes injiziert. Die Zielkomponente (Peak 3 in Abb. 3) wird in einem Lauf quantitativ isoliert. Das HPLC-Chromatogramm der Zielfraktion bestätigt dies eindrucksvoll (Abb. 4). Diese schnelle Chromatographie ist nur ohne festen Säulenträger und ohne die damit verbundenen Matrixeffekte möglich. Diese Methode wurde dann erfolgreich in den Produktionsmaßstab hochskaliert.

Applikation 2

Auftrennung von 8 Peptiden mit pH-zone-refining.
Lösungsmittelsystem: Methyl-tert.-butyl-äther/Acetonitril/Wasser, Rotorvolumen 200 ml, Fluss 5 ml/min., stationäre Phase: organisch + 44 mM TFA, mobile Phase: wässrig + 15 mM NH₃, Detektion: 254 nm, Probenaufgabe: 800 mg (100 mg je Peptid) in 20 ml stationärer Phase.

Abb. 5

Das pH-zone-refining ist perfekt zugeschnitten für die Auftrennung von polaren Verbindungen. Wegen des Austausches der mobilen Phase mit der stationären Phase während des gesamten chromatographischen Laufs erfolgt eine kontinuierliche pH-Änderung über die gesamte Länge des Rotors. Mit diesem pH-Gradienten wird die Löslichkeit und damit die Selektivität zugunsten höherer Trennleistung beeinflusst. Aufgrund des fehlenden festen Trägers gibt es keine irreversiblen Adsorptionen und daher eine hundertprozentige Wiederfindung der Probeninhaltsstoffe.

Applikation 3

Wässriges Phasensystem zur Auftrennung von Proteinen.
Rotorvolumen 200 ml, Fluss 5 ml/min, 20 mg je Protein, Phase 1: 12.5% PEG8000-25% in destilliertem Wasser. Phase 2: K₂HPO₄ + KH₂PO₄ (pH=6.5) in destilliertem Wasser

Abb. 6

Abb. 6

Die CPC-Technologie eignet sich hervorragend zur schonenden Auftrennung von Makromolekülen und Proteinen. Das PEG/Phosphat-Puffer Phasensystem zeigt exzellente Ergebnisse bezüglich der Auftrennung von Substanzen im wässrigen 2-Phasensystem. Kleinste Polaritätsunterschiede der Biomoleküle und das ausgeklügelte Kammernsystem führen zu hocheffizienten Trennungen.

Applikation 4

Chirale Trennungen mit und ohne chiralen Selektor
Rotorvolumen 200 ml, Fluss 5 ml/min, vier DNB-Aminosäure Racemate mit N-dodecanoyl-L-prolin-3,5-dimethylanilin als chiraler Selektor. Lösungsmittelsystem: Hexan-Ethylacetat-Methanol-10 mM HCl.

full-screen Abb. 7

Abb. 7

Historie und Technik der CPC

Flüssige 2-Phasen Systeme sind seit jeher eine, in der Chemie und Pharmazie verwendete Technik zur Auftrennung von Stoffgemischen. Die ersten kontinuierlich arbeitenden Apparaturen wurden nach dem Prinzip von Dr. Craig (Abb. 8) gebaut und sind bis heute noch in der Industrie vereinzelt zu finden. Für den Laboreinsatz realisiert wurde das Prinzip der kontinuierlichen Verteilungschromatographie erst durch Prof. Ito, USA, der mit Teflonschlauch gewickelte Spulen (Coils) im planetaren System rotieren lies. Firmen wie PharmaTec in den USA, Prof. Sutherland in England sowie ein Hersteller aus China führten diese Technik in ersten Anfängen in die industrielle Anwendung. Aber erst Ende des letzten Jahrhunderts, als druckstabile Rotoren aus Metall, die als „Säule“ fungierten, von der Firma Kromaton Technologies, Frankreich, entwickelt wurden, war diese Technologie für den Dauerbetrieb im industriellen Labor einsetzbar. Beispielhaft wäre hier der FCPC - Fast Centrifugal Partition Chromatograph (Abb. 9) zu nennen, in dessen Rotor (Abb. 10) sich über tausend kleine Kammern befinden, welche durch Kanäle in Serie miteinander verbunden sind. Der Rotor, der aus vielen runden Metallplatten besteht, in denen die Kammern und die Verbindungskanäle durch Kunststoffscheiben gegeneinander gedichtet sind, erlaubt Stoffgemischtrennungen von Milligramm bis Kilogramm.

Abb. 8

Im Rotor wird die stationäre flüssige Phase von einer mobilen flüssigen Phase durchströmt. Die Zentrifugalkraft bewirkt nun im Rotor die Trennung der beiden flüssigen Phasen in den einzelnen Kammern. Liegt die flüssige mobile Phase im Gleichgewicht (Equilibrium) mit der flüssigen stationären Phase vor, kann die Probe in den Rotor injiziert werden. Nun findet der Trennprozess in den beiden, nicht miteinander mischbaren Phasen statt, wobei sich die Inhaltsstoffe der Proben gemäß ihrer Verteilungskoeffizienten KD in diesen beiden flüssigen Phasen verteilen und mit verschiedener Geschwindigkeit durch die Kammern zum Rotorausgang bewegen, um fraktioniert zu werden.

Abb. 9	Abb. 10

Dabei kann eine komplette Trenneinheit aus den Komponenten HPLC-Pumpe, Probenaufgabesystem, CPC-Rotor als Säule, Detektor und Fraktionensammler bestehen.

Fazit

Aufgrund der Vorteile der CPC-Technologie wird diese häufig im Labor und in der Industrie eingesetzt. Im Gegensatz zur HPLC mit Festphasensäule ist die CPC nicht löslichkeitslimitiert und erlaubt so die Injektion von viel größeren Probenmengen bei gleichen Flussraten. Eine 100%ige Probenwiederfindung ergibt sich aus der Fraktionierung der flüssigen mobilen und der flüssigen stationären Phase, in denen alle Inhaltsstoffe enthalten sind. Diese Eigenschaften ermöglichen es dem Anwender schnell, unproblematisch und kostengünstig Proben verschiedenster Matrices aufzureinigen. Die CPC-Technologie beschleunigt in Kombination mit den Komponenten der HPLC den gesamten chromatographischen Prozess bis hin zum reinen Produkt. Dabei kann das Upscaling vom analytischen Arbeiten bis hin zur Produktion direkt durchgeführt werden, da die Trennergebnisse bei allen Rotorgrößen identisch sind und sich die Probenmengen um den Volumenfaktor direkt upscalen lassen. Auf Grund der fehlenden Festphase müssen die Flussraten nicht hochskaliert werden. In Summe sinken die Kosten für präparative Trennungen im Vergleich zur HPLC mit Festphasensäule bis um den Faktor 10.

Literaturnachweis

1. A.Berthod, in Comprehensive Analytical Chemistry, Volume 28, Countercurrent Chromatography, Elsevier Science , 2002
2. J.-M. Menet and Didier Thiébaut, Countercurrent Chromatography, Chromatographic Science Series Volume 82, Marcel Dekker, New York, Basel, 1999
3. Y.Ma, Y.Ito and A. Foucault, J. Chromatogr. A, 704 (1995) 75
4. I.A.Sutherland, L.Brown, S. Forbes, G. Games, D. Hawes, K.Hostettmann, E.H. McKerrell, A. Marston, D.Wheatley and P.Wood, J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 21(3):279 (1998)