Dynamische Lichtstreuung - ein wichtiges Werkzeug für die Protein-Kristallographie und Nanotechnologie

Dr. Gerhard Heinzmann, Bernd Tartsch
Viscotek GmbH, Carl-Zeiss-Str. 11, D-68753 Waghäusel-Kirrlach

Die dynamische Lichtstreuung (DLS) ist eine etablierte Technik im Bereich der Proteinkristallographie. Mit der DLS können hydrodynamische Radien, Verteilungsbreiten (Polydispersitäten) und Aggregationseffekte von Proteinproben bestimmt werden; wichtige Kriterien für die Kristallisierbarkeit von Proteinen. Das zweite große Anwendungsgebiet für die dynamische Lichtstreuung ist die Nanotechnologie. Die DLS ermöglicht eine schnelle und präzise Größenbestimmung von Nanopartikeln verschiedenster Materialform und Herkunft.

Abb. 1: Schematischer Aufbau eines modernen DLS-Instruments.

Dynamische Lichtstreuung

Die dynamische Lichtstreuung, auch Quasielastische Lichtstreuung (QELS) oder Photonen-Korrelations-Spektroskopie (PCS) genannt, wertet das an gelösten Makromolekülen und suspendierten Nanopartikeln gestreute Licht eines Lasers aus. Dabei kommt es aufgrund der Brown’schen Molekularbewegung zu zeitlichen Änderungen bzw. Fluktuationen der Streulichtintensität.

Ein modernes DLS-Instrument ist mit einem kompakten Diodenlaser und einer hochwertigen Faseroptik, einer so genannte Singlen Mode Fiber (SMF) Optik, ausgestattet (Abb.1). Die patentierte SMF-Optik ist die wesentliche Grundlage für eine hohe Sensitivität moderner Geräte. Diese Instrumente messen in sehr kurzen Zeitabständen die Streulichtintensität einer Probe und korrelieren die Messwerte miteinander. Durch die unterschiedlich schnellen Bewegungen von großen und kleinen Makromolekülen entsteht eine definierte Korrelationsfunktion aus der über einen mathematischen Fit der Diffusionskoeffizient D der gelösten Makromoleküle bestimmt werden kann. Aus diesem wiederum kann der hydrodynamische Radius Rh der gelösten Probe ermittelt werden:

wobei k die Boltzmann-Konstante ist, T die Temperatur und η0 die Viskosität des Lösungsmittels.

Bestechend an der DLS-Technik ist die Tatsache, dass abgesehen von der Viskosität des Lösungsmittels und dessen Brechungsindex keine weiteren Parameter für die Messung benötigt werden. Weder die Konzentration der Probe noch deren Kontrastfaktor, eine wichtige Größe in der statischen Lichtstreuung, muss bekannt sein.

Abb. 2: Aus 10 Messungen gemittelte Korrelationsfunktion einer Lysozym-Probe und daraus errechnete Verteilung der hydrodynamischen Radien der Probenmoleküle. Ergebnis Rh = 1,95 nm; Polydispersität 19,1%.

Auch die Handhabung der Geräte ist sehr einfach: es genügt eine ungefähre Menge (typischerweise 1 mg/ml) der Proteine oder Nanopartikel zu lösen oder zu suspendieren. Wenige Mikroliter der Lösung oder Suspension werden in die Meßküvette gefüllt (Volumen: 10-20 µl) und schon kann der hydrodynamische Radius der Teilchen bestimmt werden. Typische Messzeiten moderner Geräte liegen unter einer Minute.

Anwendungsbeispiel 1: Proteinkristallographie

Etabliert hat sich die DLS-Technik in den vergangenen zehn Jahren vor allem im Bereich der Proteinkristallographie. Hier hat sie sich als nützliches Werkzeug zur schnellen Untersuchung von Proteinlösungen auf deren Kristallisierbarkeit erwiesen. Weniger von Interesse sind hier die gemessenen hydrodynamischen Radien der Proteine als vielmehr deren Einheitlichkeit (Polydispersität) und das Vorhandensein von den Kristallisationsprozess störenden Proteinaggregaten.

Abb. 2: Aus 10 Messungen gemittelte Korrelationsfunktion einer Lysozym-Probe und daraus errechnete Verteilung der hydrodynamischen Radien der Probenmoleküle. Ergebnis Rh = 1,95 nm; Polydispersität 19,1%.

Abbildung 2 zeigt die aus 10 Messungen gemittelte Korrelationsfunktion eines Lysozyms und die daraus errechnete Verteilung der hydrodynamischen Radien der Probe.
Neben einigen kleinen Peaks die vom Lösungsmittel und von Verunreinigungen durch Staubpartikel herrühren wird ein Hauptpeak mit 93,8% des gesamten Streulichtes bei einem mittleren hydrodynamischen Radius von 1,95 nm gefunden. Die Polydispersität für diesen Peak beträgt 19,1%.

Abb. 3: Radienverteilung einer uneinheitlichen Protein Probe

Als Polydispersität bezeichnet man die relative Standardabweichung einer Probe. Diese kann grob in drei Kategorien unterteilen werden: als monodisopers werden Proben mit einer Polydispersität von 20% oder weniger bezeichnet. Eine Polydispersität von 20%-30% wird als mittlerer Wert betrachtet, ist die Polydispersität > 30% dann ist die Probe sehr uneinheitlich.

Die vorhandene Lysozym-Spezies kann daher als monodispers angesehen werden. Ein solches Resultat lässt auf eine gute Kristallisierbarkeit der Proteinmoleküle schließen; eine Garantie für die Bildung von Kristallen ist es aber nicht.

Ein Beispiel für eine uneinheitliche Protein Probe zeigt Abbildung 3: Hier ist ein schmaler Peak bei einem hydrodynamischen Radius von 6,21 nm zu erkennen (Polydispersität 28,9%). Gleichzeitig sind aber weitere Peaks bei 41,4 nm und 212,5 nm mit einer breiten Verteilung zu erkennen, sowie einige Staubpartikel mit einer Größe im Mikrometer-Bereich. Die Chancen für eine Kristallisierbarkeit dieser Probe sind daher als gering anzusehen. Außerdem ist bei dieser Probe eine Filtration sinnvoll, um die störenden Staubpartikel zu entfernen.

Abb. 4: Analyse einer Suspension von keramischen Nanopartikeln in Wasser. Ergebnis: Rh = 7,13 nm, Polydispersität 19,8%.

Anwendungsbeispiel 2: Nanotechnologie

Schon seit längerer Zeit wird die DLS-Technik auch in der Nanotechnologie zur Größenbestimmung von Nanoteilchen eingesetzt. Bezüglich der Materialeigenschaften der Nanoteilchen sind nahezu keine Grenzen gesetzt. Es können keramische und metallische Partikel wie auch Metalloxidpartikel, Polymer- und Latexpartikel in verschiedensten Lösungsmitteln gemessen werden. Der Größenbereich erstreckt sich von ca. 1 nm bis 1000 nm.

Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für eine Suspension von keramischen Nanopartikeln in Wasser: es wird eine monodisperse Teilchenspezies mit einem hydrodynamischen Radius von 7,13 nm gefunden. Die folgende Abbildung zeigt, dass die DLS-Technik auch in der Lage ist verschiedene Teilchenspezies in einer Mischung zu erkennen. In diesem Beispiel werden zwei diskrete Teilchenspezies mit einem Radius von 1,87 nm und 5,31 nm gefunden. Um die verschiedenen Teilchengrößen in der Mischung getrennt detektieren zu können, darf allerdings ein bestimmter Größenunterschied der Teilchenspezies nicht unterschritten werden. Als Faustregel für den minimalen Größenunterschied ist ein Faktor von 1,5 – 2 im Radius nötig.

Abb. 1: Schematischer Aufbau eines modernen DLS-Instruments.

Ein weiterer kritischer Punkt bei Mischungen ist das Konzentrationsverhältnis. Hält man sich vor Augen, dass ein zehnmal größeres Teilchen eine Million Mal mehr Licht streut, dann wird schnell verständlich, dass eine große Menge an großen Teilchen schnell eine kleine Menge an kleinen Teilchen völlig überstrahlen kann. Dies ist auch der Grund dafür, dass DLS-Proben hin und wieder filtriert werden müssen. Sind zuviel große Staubpartikel in einer Probe, dann stört das starke Streulicht dieser großen Partikel die Detektion von kleineren Partikeln, auch wenn diese gegebenenfalls in höherer Konzentration vorliegen. Sind störende Partikel durch einen einfachen Spritzenfilter erst einmal entfernt, dann können auch kleine Partikel bis ca. 1 nm Radius reproduzierbar gemessen werden. Die Nachweisgrenze der DLS-Technik ist dann erreicht, wenn sich die zu messenden Teilchen in Ihrer Molekularbewegung nicht mehr von Lösungsmittel unterscheiden bzw. wenn die Konzentration der Teilchen zu gering wird.

Zusammenfassung

Die dynamische Lichtstreuung ist eine leistungsstarke Technik im Bereich der Proteinkristallographie und der Nanotechnologie. Mit Ihrer Hilfe können zuverlässig hydrodynamische Radien, Polydispersitäten und Aggregationen von Proteinmolekülen und Nanoteilchen bestimmt werden. Vorteile der modernen, auf einer Single Mode Fiber-Optik basierenden Gerätetechnik sind die hohe Empfindlichkeit der Instrumente und die sehr kurzen Messzeiten die in aller Regel unter einer Minute liegen. Außerdem ist die Handhabung sowohl der Geräte wie auch der Software sehr vereinfacht worden, so dass auch ungeschultes Personal exakte und zuverlässige Ergebnisse erzielen kann. Die moderne Optik heutiger Geräte erlaubt die Analyse vieler Proben auch ohne vorhergehende Filtration. Somit kann die DLS-Technik noch effektiver in der Nanotechnologie und Proteinkristallographie eingesetzt werden.

Fakten, Hintergründe, Dossiers
  • Nanotechnologie
  • Konzentration
  • Streulicht
Mehr über Malvern
Ihr Bowser ist nicht aktuell. Microsoft Internet Explorer 6.0 unterstützt einige Funktionen auf Chemie.DE nicht.