Einfache Untersuchung von klinischen Proben mit der Graphitrohrofen-AAS

Marcus Hasel, PerkinElmer LAS (Germany) GmbH

PerkinElmer LAS (Germany) GmbH

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1. Einleitung

In klinischen Laboratorien gehört die Untersuchung von Serum- und Blutproben zur täglichen Routine. Gefordert wird ein einfaches und schnelles Verfahren, das leicht automatisierbar ist und mit einem geringen Probenbedarf auskommt [1]. Im Folgenden werden daher an den Beispielen Blei in Vollblut und Selen in Serum einfache Analysenmethoden mit der Graphitrohrofen-AAS vorgestellt.

Blei gehört gehört aufgrund seiner Toxizität zu den häufig untersuchten Elementen in Körperflüssigkeiten. Die Bestimmung ist sowohl von umweltmedizinischem, als auch von arbeitsmedizinischem Interesse. Da Blei vorwiegend an den Erythrozyten gebunden ist, erfolgt seine Bestimmung meist im Vollblut [2].

Selen ist für den Menschen ein essentielles Spurenelement. Ein Selenmangel wird mit zahlreichen Erkrankungen in Verbindung gebracht [3]. Eine Selenbestimmung wird meist im Serum oder Plasma durchgeführt.

2. Experimentelles

2.1 Verwendete Geräte

Abbildung 1: PerkinElmer AAnalyst 800.

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Die Bleibestimmung in Vollblut und die Selenbestimmung im Serum wurden mit einem AAnalyst 800 durchgeführt. Das Spektrometer zeichnet sich durch eine lichtstarke Optik und einen nachweisstarken Halbleiterdetektor aus. Durch seinen querbeheizten Graphitrohrofen und der Zeeman-Untergrundkompensation kann der Analyt auch in anspruchsvoller Matrix wie Vollblut und Serum problemlos bestimmt werden. Als Graphitrohr dient aufgrund der höheren Empfindlichkeit ein Endkappenrohr. Als Strahlungsquelle wurden eine Blei- und eine Selen-EDL eingesetzt. Diese bewirken durch ihre höhere Intensität ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis und damit niedrigere Nachweisgrenzen.

2.2 Reagenzien

Proben:
Seronorm Whole Blood, Trace Elements, Level 2
Seronorm Serum, Trace Elements
Recipe Serum CC II
Standards: Pb 20 µg/l aus einer 1000 µg/l Stammlösung;
Se 25 µg/l aus einer 1000 µg/l Stammlösung;
Verdünnung mit Reinstwasser (Millipore Milli-Q Plus;18,2 MΩcm);
Ansäuern mit HNO3 suprapur
Matrixmodifier Pb: (NH4)H2PO4 / Mg(NO3)2
1 ml (NH4)H2PO4-Lösung (100 g/l) und 0,1 ml Mg(NO3)2-Lösung (10 g/l) werden mit Reinstwasser auf 10 ml aufgefüllt
Matrixmodifier Se: Pd(NO3)2/ Mg(NO3)2
1 ml Pd(NO3)2-Lösung (10 g/l) und 0,1 ml Mg(NO3)2-Lösung (10 g/l) werden mit Reinstwasser auf 10 ml aufgefüllt

Zum Verdünnen der Proben wird eine Lösung aus 1 ml Triton X-100 und 200 µl HNO3 suprapur mit Reinstwasser auf 100 ml aufgefüllt.

2.3 Probenvorbereitung

Die Probenvorbereitung ist häufig ein sehr zeit- und damit auch kostenintensiver Arbeitsschritt im Analysenablauf. Bei einem Säureaufschluss kommt es zudem leicht zu einer Kontamination der Proben. Eine möglichst einfache Probenvorbereitung dient daher neben wirtschaftlichen Aspekten auch der Richtigkeit der Analysenergebnisse.

Die Probenvorbereitung besteht bei der Bestimmung von Blei in Vollblut und Selen in Serum lediglich aus einem Verdünnen der Proben mit der zuvor hergestellten Triton-X-100-Lösung. Bei der Bleibestimmung ist die Verdünnung abhängig von der Konzentration in der Probe. Arbeitsmedizinische Proben enthalten häufig deutlich höhere Bleikonzentrationen als umweltmedizinische Proben. Wichtig ist, dass der lineare Arbeitsbereich der Messung nicht überschritten wird. Bei niedrigen Konzentrationen hat sich eine Verdünnung 1+9 als geeignet herausgestellt [4], bei hohen Konzentrationen auch 1+49. Bei der Bestimmung von Se in Serum gelangt man aufgrund des geringeren Schwankungsbereiches meist mit einer 1+9 Verdünnung zu guten Ergebnissen.

2.4 Messung

Im Folgenden werden die Analysenmethoden vorgestellt und die Besonderheiten erklärt. Hierdurch ist es leicht möglich, die Methoden auch für andere Elemente zu adaptieren.

Blei und Selen werden unter den standardisierteten STPF-Bedingungen bestimmt. Die Wellenlänge für Blei beträgt 283,3 nm bei einer Spaltbreite von 0,7 nm. Die Wellenlänge für Selen beträgt 196,0 nm bei einer Spaltbreite von 2,0 nm. Die Auswertung der Signale erfolgt jeweils über Peakfläche mit Zeeman-Untergrundkompensation.

Tabelle 1: Dosiervolumen.

Lösung
Dosiervolumen [µl]
Probe 20
Verdünnungslösung / Aufstockung 20
Modifier 5

Die Messungen der Konzentration von Blei in Vollblut und Selen im Serum erfolgen mit der Methode der Additionskalibration. Das bedeutet, dass mit der ersten Probe eine Standardaddition durchgeführt wird. Alle weiteren Proben werden gegen die hierbei ermittelte Steigung gemessen. Der zeitliche Mehraufwand bei Probenserien ist hierdurch kaum höher als bei einer Kalibration gegen wässrige Standards.
Eine Additionskalibration ist immer dann möglich, wenn sich die einzelnen Proben in ihrer Matrix untereinander nur unwesentlich unterscheiden. Im Allgemeinen gilt dies für Vollblut-, Serum- und Plasmaproben, nicht jedoch für Urinproben. Diese können in ihrem Salzgehalt stark variieren.

Der Autosampler des Spektrometers lässt sich so programmieren, dass zunächst Modifier und Verdünnungslösung und nach einem Spülschritt die Probe in das Graphitrohr pipettiert wird. Die Blut- bzw. Serumprobe und der saure Modifier werden erst im Graphitrohr gemischt. Ein Ausflocken von Eiweiß in der Pipettierkapillare, das zu Verstopfungen oder Memoryeffekten führen kann, wird damit vermieden.

Die Standards für die Aufstockung der Probe (Pb: 5 µg/l, 10 µg/l, 20 µg/l; Se: 12,5 µg/l, 25 µg/l) werden vom Autosampler eigenständig hergestellt. Das Ansetzen der einzelnen Standards sowie das manuelle Aufstocken der Probe können somit entfallen.

Tabelle 2: Temperaturprogramm Pb.

Schritt
Temp. [°C]
Rampe
Halten
Interner Gasfluss
Gas
Detektor
1 110 1 30 250 Argon
2 130
15 40 250 Argon
3 550 15 15 250 Druckluft
4 550 1 20
250 Druckluft
5 850 20 30 250 Argon
6 1600 0 3 0 Argon Read
7 2450 1 3 250 Argon

Das Herzstück der Blei-Methode ist das Temperaturprogramm. Die ersten beiden Schritte im Temperaturprogramm betreffen die Trocknung der Probe. Ein zweistufiges Trocknungsprogramm hat sich für alle Matrices als vorteilhaft erwiesen. Schritt 2 ist gegenüber den Vorgabewerten leicht verlängert (Haltezeit 40 s). Dadurch wird auch das durch die Aufstockung der Probe vergrößerte Dosiervolumen sicher und schonend getrocknet.

Schritt 3 wird als Luftveraschung bezeichnet. Bei einer Temperatur von 550 °C wird Druckluft (statt Argon) durch das Graphitrohr geleitet. Die organischen Bestandteile der Probe werden hierbei verascht und aus dem Graphitrohr entfernt [5]. Somit wird quasi ein Aufschluss vollautomatisch im Graphitrohr durchgeführt. Durch seine pyrolytische Beschichtung wird das Graphitrohr bei dieser Temperatur nicht angegriffen.

In Schritt 4 wird das Rohr mit Argon gespült. Es darf sich bei den folgenden höheren Temperaturen keine Luft mehr im Graphitrohr befinden. Diese würde die Lebensdauer des Graphitrohres deutlich verkürzen.

In Schritt 5, dem Pyrolyse-Schritt, werden weitere Matrixbestandteile wie Salze entfernt. Der Analyt wird durch den Modifier stabilisiert und verbleibt im Rohr.

Die eigentliche Atomisierung der Probe erfolgt in Schritt 6 mit schnellstmöglicher Aufheizrate (Rampe 0) bei einer Temperatur von 1600 °C. Hier findet auch die Messung des Analytsignals statt (Read). Damit die Atomwolke möglichst lange im Rohr bleibt, wird der Argongastrom während der Atomisierung ausgeschaltet (Gasstop).

In Schritt 7 wird das Graphitrohr bei 2450 °C unter Argonspülung ausgeheizt. Schwerflüchtige Matrixbestandteile werden hierbei aus dem Rohr entfernt. Das System ist anschließend bereit für die nächste Messung.

Tabelle 3: Temperaturprogramm Se.

Schrttt Temp. [°C] Rampe Halten Interner Gasfluss Gas Detektor
1 110 1 30 250 Argon  
2 130 15 40 250 Argon  
3 550 15 15 250 Druckluft  
4 550 1 20 250 Druckluft  
5 1000 15 35 250 Argon  
6 2050 0 3 0 Argon Read
7 2450 1 3 250 Argon  

Das Temperaturprogramm für die Selen-Bestimmung erfolgt analog dem der Bleibestimmung. Lediglich der Pyrolyseschritt (Schritt 5) und der Atomisierungsschritt (Schritt 6) wurden für den Analyten angepasst.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1 Bleibestimmung

Abbildung 2: Ergebnis der Vollblutanalyse.

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In dem Seronorm Vollblut wurden 373 µg/l Pb gefunden. Zertifiziert ist eine Pb-Konzentration von 401 µg/l (353 µg/l - 443 µg/l). Somit liegt das Ergebnis der Messung sicher im zertifizierten Bereich.

Abbildung 3: Pb-Signal der nicht aufgestockten Vollblut-Probe.

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Das Messsignal der nicht aufgestockten Probe liegt weit vom Geräterauschen entfernt. Niedrigere Pb-Konzentrationen aus umweltmedizinischen Proben können auch aus einer 1+9 Verdünnung gemessen werden.
Die Zeeman-Untergrundkompensation kann Analytsignal (durchgezogene Linie) und Untergrundsignal (gestrichelte Linie) sicher voneinander unterscheiden.

3.2 Selenbestimmung

Abbildung 4: Ergebnis der Serumanalyse.

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In dem Seronorm Serum Trace Elements wurden 81 µg/l Se gefunden. Zertifiziert ist eine Se-Konzentration von 83 µg/l. Im Recipe CC II-Serum wurde eine Se-Konzentration von 76 µg/l gemessen. Zertifiziert ist eine Se-Konzentration von 71 µg/l (53 µg/l - 89 µg/l). Somit liegen beide Ergebnisse sicher im zertifizierten Bereich.

Abbildung 5a: Se-Signal der nicht aufgestockten Serum-Probe (Seronorm).

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Abbildung 5b: Se-Signal der nicht aufgestockten Serum-Probe (Recipe).

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Auch bei der Selen-Bestimmung liegen beide Signale weit vom Geräterauschen entfernt.

4. Zusammenfassung

Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigen, dass die Bestimmung von Blei in Vollblut und Selen im Serum mit der Graphitrohr-AAS auf sehr einfache Weise möglich sind. Durch die Luftveraschung im Temperaturprogramm kann auf einen zeitaufwändigen und kontaminationsgefährdeten Aufschluss verzichtet werden.

Die Methode lässt sich leicht durch Anpassen der Pyrolyse- und Atomisierungstemperaturen an weitere Analyten anpassen.

Bei der Untersuchung von Vollblut und Serum kann mit einer zeitsparenden Additionskalibration gearbeitet werden.

5. Literatur

[1] Welz: Einsatz der Atom-Absorptions-Spektrometrie zur Spurenelementbe-stimmung in Körperflüssigkeiten und Geweben, Ärztl. Lab. 25, 168-177 (1979).

[2] Welz, Sperling: Atomabsorptionsspektrometrie, 4. Auflage 1999, Wiley-VCH.

[3] Van Dael, Van Cauwenbergh, Robberecht, Deelstra: Determination of Se in Human Serun by AAS Using Electrothermal Atomization with longitudinal Zeeman-Effect Background Correction or Flow Injection Hydride Generation, Atomic Spectroscopy, November/December 1995.

[4] Cheng-Chieh Yen, Wen-Kang Chen, Chao-Chin Hu, Bai-Luh Wei, Chien Chung, Sheng-Chu Kuo: Lead Determination in Whole Blood by Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry, Atomic Spectroscopy Vol, 18(2), March/April 1997.

[5] Shuttler, Delves: Determination of Lead in Blood by Atomic Absorption Spectrometry with Electrothermal Atomisation, Analyst, June 1986, Vol. III.

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