Field-Flow Fractionation - Universelles Trennprinzip zur Charakterisierung von Partikeln und Makromolekülen

Dr. Tino Otte, Dr. Thorsten Klein, Dipl.-Chem. Evelin Moldenhauer
Postnova Analytics GmbH, Max-Planck-Straße 14, DE-86899 Landsberg/Lech

Hochmolekulare Polymere, Biomoleküle oder Partikel in einem Bereich von wenigen Nanometern bis hin zu mehreren Mikrometern gewinnen in jüngster Zeit immer mehr an Bedeutung. Zahlreiche Anwendungen basieren auf den speziellen Eigenschaften dieser Materialien. Aus diesem Grund ist eine exakte Kenntnis der Molekulargewichte oder Teilchengrößen und ihrer Verteilung unabdingbar für die spätere Anwendung sowie für die Optimierung von Herstellungsprozessen oder in der Qualitätskontrolle. Bei Makromolekülen oder Biopolymeren ist zusätzlich die Kettenstruktur ein wichtiger Parameter, während bei Partikeln z.B. die Form eine Rolle spielt. Aus diesem Grund müssen die oftmals komplexen Probensysteme nach Parametern wie der Teilchengröße oder dem Molekulargewicht aufgetrennt und anschließend detektiert werden. Dabei ist eine schonende und vollständige Separation essentiell, da sonst auch mit den besten Detektoren komplett falsche Informationen über das Probensystem erhalten werden [1-3]. Bisher war die Auftrennung von sehr großen oder stark adsorbierenden Materialien nur teilweise z.B. mit chromatographischen Techniken wie z.B. GPC/SEC, HPLC oder mit Methoden wie z.B. der Ultrazentrifuge, Löslichkeitsfraktionierung oder optischer Auswertung (Mikroskopie) möglich.

Die säulenchromatographischen Trennmethoden basieren auf der Separation des Analyten in einer meist porösen stationären Phase. Aufgrund der hohen Scherkräfte und der starken Adsorptionsgefahr durch die große Oberfläche der Säulenfüllung eignen sie sich somit eher für niedermolekulare Anwendungen. Stark wechselwirkende, langkettige oder hoch verzweigte Polymere aber auch Partikel können oft nicht oder nur unzureichend mit diesen Methoden charakterisiert werden. Offlinetechniken liefern zwar bessere Resultate, sind dafür aber meist nicht universell einsetzbar, sehr teuer oder die Trennprozesse sind extrem langwierig und aufwendig.

Die Charakterisierung mittels Feldflussfraktionierung bietet heute die Möglichkeit einer universellen und hochauflösenden Trennung mit anschließender Detektion für Strukturen im einstelligen Nanometerbereich [4] bis hin zu Mikrometerpartikeln [5] ohne Scherabbau, Filtration der Probe oder unerwünschter Adsorption an einer stationären Phase. Die gelösten oder im Laufmittel dispergierten Moleküle oder Partikel werden in einem leeren Trennkanal nach Größe, Zusammensetzung oder Dichte separiert. Ein externes Kraftfeld, welches senkrecht zur  Flussrichtung  wirkt, ist die Grundlage für die Trennung der Probenteilchen. Je nach Gerätetyp wird ein Querflussgradient (Asymmetrische Fluss FFF - AF4), ein Temperaturgradient (Thermische FFF - TF3) oder ein Zentrifugalfeld (Centrifugal FFF - CF3) verwendet. Das Querflussfeld führt zu einer Anreicherung des Analyten an der Kanalwand. Die größenabhängige Eigendiffusion der Teilchen führt anschließend zu einer Anordnung von Strukturen verschiedener Größe in unterschiedlich schnellen Strömungsschichten des parabolischen Strömungsprofils im Kanal, wodurch die Größenseparation erreicht wird.

Bei der Thermischen FFF wird ein Temperaturgradient zur Trennung der Teilchen verwendet. Da die resultierende thermische Diffusion auch von der chemischen Natur des Analyten abhängt, kann mit dieser Methode nach Größe und chemischer Zusammensetzung separiert werden, wodurch auch Komponenten mit gleichen hydrodynamischen Radien aber unterschiedlicher Zusammensetzung getrennt werden können.

Die Centrifugal FFF nutzt ein Zentrifugalfeld, welches durch Rotation des Kanals erzeugt wird. Mit dieser Methode kann neben der Größenseparation auch nach Dichteunterschied getrennt werden, wodurch sich ideale Anwendungsmöglichkeiten im Bereich partikulärer Proben ergeben, da der Dichteeinfluss sehr hohe Trennleistungen auch für extrem kleine Partikel ermöglicht.

Alle Trennfelder lassen sich als stufenloser Gradient in ihrer Stärke regulieren. Die Trennleistung kann somit an jedes Trennproblem individuell angepasst und eine „maßgeschneiderte“ Kalibrationskurve kann beliebig definiert werden, eine Begrenzung der Trennleistung durch z.B. die Vorgabe einer bestimmten Säulenkombination, wie in der SEC, entfällt.

In der FFF können beliebige Detektorkombinationen eingesetzt werden. Insbesondere Vielwinkellichtstreudetektoren (Multi-Angle Light Scattering - MALS) haben sich in Kombination mit konzentrationssensitiven Detektoren, wie z.B. RI, IR oder UV, bewährt, da sie den Radius und das Molekulargewicht zugänglich machen und somit eine Vielzahl von Informationen über die getrennte Probe liefern [6]. Auch andere Kombinationen wie z.B. eine Kopplung mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) [7], Viskosimetern [8] oder Spektrometern, wie z.B. ICP-MS [9], sind ohne großen Aufwand realisierbar.

Abb. 1: Trennung eines Gemisches aus eng verteilten Polystyrol Standards in THF und von vernetzten Latexpartikeln in Wasser. Das Molekulargewicht wurde mittels MALS-Detektion überprüft, die Herstellervorgabe (Masse bei PS-Standards, Durchmesser bei Latex) ist jeweils im Fraktogramm aufgeführt. Die Elution in der FFF erfolgt, anders als z.B. in der SEC, nach steigendem hydrodynamischen Volumen.

Anwendung der Trenntechniken

Die AF4 kann sowohl für Polymere als auch zur Trennung von Partikeln verwendet werden. Die Separation erfolgt rein nach dem hydrodynamischen Radius der Teilchen und ist somit sehr universell. Die Fraktogramme in Abb. 1 demonstrieren den breiten Trennbereich sowie die Variierbarkeit der mobilen Phase und des Analyten. Eine Trennung mit hoher Auflösung ist problemlos über einen weiten Größenbereich hinweg und innerhalb einer relativ kurzen Analysezeit möglich.

Die Leistungsfähigkeit der AF4 gegenüber herkömmlichen Methoden lässt sich leicht anhand von Trennungen hochmolekularer oder stark verzweigter Polymere belegen. In Abb. 2 sind zwei Beispiele für die AF4- und SEC-Trennung von technischen Proben dargestellt, die aufgrund ihrer hohen Molekulargewichte und des starken Verzweigungsgrades wichtige Materialeigenschaften wie Stabilität und niedrige Viskosität in Schmelze oder Lösung vereinen.

Abb. 2: Trennung verschiedener synthetischer Polymere mit AF4 und SEC. Die Radien und Molekulargewichte wurden mittels MALS-Detektion bestimmt.

Die Gegenüberstellung von AF4 und SEC-Trennung zeigt eindrucksvoll die Überlegenheit des FFF-Prinzips und die dadurch erhaltenen Zusatzinformationen wie z.B. exaktes Molekulargewicht und komplette Verzweigungsinformation. Aufgrund der starken Scherbelastung und der partiellen Retention großer Makromoleküle lassen sich die SEC-MALS-Daten für keine der beiden Proben korrekt auswerten. Die AF4 ist in einem Temperaturbereich von 5 bis 220°C einsetzbar, wodurch sie sich für die Analyse der meisten polymeren Materialien verwenden lässt.

Eine wichtige polymere Stoffklasse sind die Polyolefine, welche als Massenkunststoff die Welt erobert haben und somit den mit Abstand am häufigsten verwendeten makromolekularen Werkstoff darstellen. Insbesondere die hochmolekularen Polyolefine sind besonders scherempfindlich und verfügen oft zusätzlich  über Kettenverzweigungen, welche in der SEC zu umfangreichen Problemen führen. Auch Kautschuke können mittels AF4 optimal charakterisiert werden. Durch die vielfältige Anwendung z.B. in Fahrzeugreifen ist hier eine exakte Analyse besonders wichtig. Die SEC liefert für solche Materialien leider oft nur sehr unzureichende Informationen. Bei der in Abb. 2 gezeigten Kautschuk-Probe wurde ein Großteil der hochmolekularen Teilchen nicht in der SEC gefunden, die AF4 hingegen zeigt die wahren Molekulargewichte und Verzweigungsinformationen. Sie ermöglicht somit einen neuen Blickwinkel auf viele schon als vollständig verstanden geglaubte Materialien. Da die Probe bei einer AF4-Analyse nicht durch eine Säulenfüllung filtriert wird, werden auch hochmolekulare Gelanteile sichtbar. Diese zeigen sich z.B. in Abb. 2 als bimodales Lichtstreusignal und in einem sehr niedrigen Anstieg der Rg-M-Beziehung bei hohen Molekulargewichten.

In analoger Weise können neben den synthetischen Polymeren auch beliebige natürliche Materialien, wie z.B. Proteine, Stärken oder Alginate, separiert werden. Auch eine Auftrennung höherer biologischer Strukturen wie z.B. Antikörper, Mizellen oder Viren sowie die Separation von partikulären Proben, wie z.B. Carbon Nanotubes, Kolloiden oder Tonerpartikeln, ist problemlos realisierbar.

Durch die Verwendung eines Querflussgradienten können in der AF4 neben der universellen und scherfreien Trennung noch weitere Vorteile genutzt werden. Eine Fokussierung der Probe zu Beginn der Separation ermöglicht z.B. die Anreicherung von sehr stark verdünnten Lösungen. Durch einen zweiten Einlassstrom wird die Probe in einer engen Zone am Kanaleingang fokussiert. Einer möglichen Bandenverbreiterung durch die Längsdiffusion der Analytteilchen wird so effektiv entgegengewirkt und das spätere Detektorsignal in seiner Intensität deutlich erhöht. Die Injektionsdauer kann nahezu beliebig gewählt werden. Zusätzlich ist es möglich das Detektorsignal auch durch die Slot Outlet Technologie extrem zu verstärken. Hierbei wird die obere Laufmittelschicht im Kanal, welche keine Analytteilchen enthält, abgesaugt und so der Verdünnung der Probe zugunsten eines optimalen Signal-zu-Rausch Verhältnisses entgegengewirkt.

Neben der universell nach der hydrodynamischen Größe trennenden AF4 ermöglicht die Thermische FFF (TF3) zusätzlich noch eine Separation nach der chemischen Zusammensetzung des Analyten. So ist es möglich z.B. Polystyrol- (PS) und Polymethylmethacrylatmoleküle (PMMA) mit gleichen hydrodynamischen Radien voneinander abzutrennen. In Abb. 3 ist das Fraktogramm der Separation von PS und PMMA mit der TF3  abgebildet, zusätzlich wurde der Versuch einer SEC-Trennung gegenübergestellt.

Abb. 3: Separation von zwei engverteilten Polymerstandards aus PS und PMMA - unzureichende Trennung in der SEC aufgrund des gleichen hydrodynamischen Volumens und erfolgreiche Abtrennung mit der Thermischen FFF aufgrund der unterschiedlichen thermischen Diffusionskoeffizienten beider Materialien.

Wie in der Abb. 3 deutlich zu erkennen ist, kann mit der SEC aufgrund der gleichen hydrodynamischen Radien beider Standards keine Abtrennung erreicht werden. Das abfallende Molekulargewicht ergibt sich durch die unterschiedlichen Brechungsindizes der beiden co-eluierenden Materialien in THF. Die Thermische FFF zeigt hingegen eine gute Auftrennung in zwei separate Peaks, wobei PMMA durch seine stärkere thermische Diffusion später eluiert als das PS. Die gute Trennung ermöglicht die einzelne Auswertung der Molekulargewichte mit unterschiedlichen  Brechungsindexinkrementen (Das Brechungsindexinkrement kennzeichnet die Änderung des Brechungsindex der Analytlösung mit der Konzentration und geht mit in die Molekulargewichtsberechnung ein). Der gemessene Molekulargewichtswert sowie die im Peak konstanten Molekulargewichte bestätigen eine korrekte Abtrennung der fast monodispersen Polymerstandards.

Eine speziell für Partikel geeignete FFF-Methode ist die Centrifugal FFF (CF3). Durch die Rotation des runden Trennkanals wird ein Zentrifugalfeld erzeugt welches neben einer Größenseparation auch die Trennung nach unterschiedlicher Dichte ermöglicht. Durch den zusätzlichen Einfluss des Dichteunterschiedes und die grundsätzlich hohe Selektivität für besonders dichte Materialien ist die Auflösung dieser Methode in vielen Fällen der AF4 noch überlegen. In Abb. 4 ist die Trennung von Goldstäbchen unterschiedlicher Größe mit AF4 und CF3 dargestellt. Ein Vergleich mit der SEC ist für derartige Partikel nicht sinnvoll, da die Goldteilchen sehr stark an der stationären Phase adsorbieren und somit meist in der Säule verbleiben.

Abb. 4: Trennung von Gold-Nanopartikeln unterschiedlicher Form und Größe mit AF4 und CF3. Die Effizienz der FFF-Trennung wurde durch Mikroskopie überprüft.

Fazit

Die FFF-Technologie stellt allein durch ihre breite Einsetzbarkeit und Flexibilität eine sehr universelle Trennmethode dar. Darüber hinaus bietet sie hervorragende Trennleistungen auch für sehr große bzw. hochmolekulare Teilchen und ermöglicht so auch die Separation von Proben, die mit den bisherigen Methoden nicht analysierbar waren. Die freie Einstellbarkeit der Trennkraft und Features, wie Fokussierung oder Slot Outlet, bieten bisher unbekannte Möglichkeiten zur Methodenoptimierung. Durch die Vielzahl der möglichen Trennfelder ergeben sich maßgeschneiderte Lösungen für die meisten analytischen Probleme. Durch die zahlreichen Vorteile und die bisher unerreichte Robustheit der Geräte wird sich die FFF-Technologie auch in Zukunft einen immer größeren Stellenwert unter den analytischen Trenntechniken einnehmen.

Literatur

[1]     M. Parth, N. Aust, K. Lederer, Int. J. Polym. Anal. Charact. 8, 2003, 175.

[2]     N. Aust, J. Biochem. Biophys. Meth. 6, 2003, 323.

[3]     M. D. Zammit, Polymer 39, 1998, 5789.

[4]     F. A. Messaud, R. D. Sanderson, J. R. Runyon, T. Otte, Prog. Polym. Sci. 34, 2009, 351.

[5]     S. K. Ratanathanawongs, J. C. Giddings, Anal. Chem. 64, 1992, 6.

[6]     T. Otte, R. Brüll, T. Macko, H. Pasch, J.  Chrom. A 1217, 2010, 722.

[7]     K. D. Caldwell, J. Li, J.-T. Li, D. G. Dalgleish, J. Chrom. A 604, 1992, 63.

[8]     E. P. C. Mes, H. de Jonge, T. Klein, R. Welz, D. T. Gillespie, J. Chrom. A 1154, 2007, 319.

[9]     M. Hasselöv, B. Lyven, C. Haraldson, W. Sirinawin, Anal. Chem. 71, 1999, 3497.

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