Asymmetrische Fluss-Feldfluss-Fraktionierung - eine leistungsfähige Methode zur Polymercharakterisierung

Stepan Podzimek,¹ Petr Lebeda,² Christoph Johann,³ Thomas Jocks³
¹SYNPO, 532 07 Pardubice, Czech Republic
²University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Polymeric Materials, 532 10 Pardubice, Czech Republic
³Wyatt Technology Europe, DE-56307 Dernbach, Germany

Einleitung
Die asymmetrische Fluss-Feldfluss-Fraktionierung (AF4) ist eine Separationstechnik, die über Jahrzehnte hinweg ein Schattendasein führte neben der hauptsächlich angewandten Größenausschlusschromatographie (size exclusion chromatography, SEC). Der Grund hierfür ist vor allem darin zu sehen, dass dieser Technik bis vor wenigen Jahren noch ein eher experimenteller Charakter zugeschrieben wurde, denn trotz eingehender theoretischer Beschäftigung mit dieser Thematik fehlte es an Instrumenten, mit denen sich einfach und zuverlässig arbeiten ließ, vor allem im Bereich von Routineanwendungen. Daher entwickelte sich die SEC auch in der Polymercharakterisierung zur vorherrschenden Methode.

Doch mit der Entwicklung neuer Generationen kommerziell erhältlicher AF4-Instrumente wie der Wyatt Eclipse tritt diese Technologie aus dem Schatten der SEC heraus und wird in einer stetig steigenden Zahl von Anwendungen eingesetzt. Dies liegt an einigen Merkmalen, die der AF4 gegenüber der SEC gerade in der Polymeranalytik zum Vorteil gereichen. Neben dem enorm breiten Trennbereich ist es vor allem die weitgehende Abwesenheit  von Scherkräften, die in der SEC immer wieder zu unerwünschten Einflüssen auf die Probe führte. Auch die Interaktion von Probenbestandteilen mit dem Säulenmaterial sorgte für Probleme, die in der Feldflussfraktionierung nicht auftreten, weil es hier keine stationäre Phase gibt. Weitere Vorteile der AF4 liegen in der hohen Flexibilität bezüglich der Probenkonzentration und der Möglichkeit, die mobile Phase schnell zu wechseln.  Besonders bei der Trennung von verzweigten Polymeren zeigt die Feldflussfraktionierung gegenüber der SEC ihre Stärken.

In dieser Abhandlung werden die Grundlagen der AF4 dargestellt und gezeigt, dass diese Technik in Bezug auf ihre Leistungsfähigkeit der SEC durchaus ebenbürtig ist und bei manchen Fragestellungen in der Polymeranalytik sogar die überlegene Methode darstellt.

Grundlagen der asymmetrischen Feld-Fluss-Fraktionierung (AF4):
Die Auftrennung der Probe erfolgt in einem Kanal, der aus zwei Platten besteht, zwischen die eine Spacerfolie eingelegt ist. Die Spacerfolie besitzt einen Ausschnitt, der zusammen mit Deckel- und Bodenplatte den eigentlichen Trennkanal bildet. Seine Oberseite undurchlässig, während der Boden des Kanals mit einer Fritte und einer für die Trennung geeigneten Membran ausgestattet ist. Wird nun ein Flüssigkeitsstrom durch den Kanal gepumpt, kann ein Teil der Strömung durch den Boden austreten und bildet eine Querströmung (Cross-flow) im Verhältnis zur Hauptströmung, die entlang des Kanals Richtung Auslass gerichtet ist. Durch Einwirkung des Querstromes, die sich überlagert mit dem parabolischen Flussprofil der Längsströmung, erfolgt eine Trennung der Probenbestandteile. Zuerst sind die unterschiedlichen Größen und Molmassen der Probe diffus verteilt (Schritt 1). Während der  Fokussierung (Schritt 2) wird die Probe nur dem Querstrom ausgesetzt und der Kanalfluss ist abgeschaltet. Die Probenbestandteile erfahren eine Reibungskraft in Richtung der Kanalunterseite (Akkumulationswand) und werden dort entsprechend aufkonzentriert, wodurch wiederum eine Rückdiffusion bewirkt wird, die dem Konzentrationsgradienten entgegenwirkt. Beide Kräfte sind grössenabhängig, die Reibungskraft zunehmend und die Diffusion abnehmend mit dem Stokes Radius des jeweiligen Teilchens. Nach einer gewissen Zeit bildet sich ein stationäres Gleichgewicht der beiden Kräfte aus, in dem jede Molekülgröße einen mittleren Abstand zur Akkumulationswand einnimmt. Die kleineren Moleküle diffundieren mehr in die Kanalmitte, die größeren Moleküle verbleiben eher in geringerer Höhe und damit in der Nähe der Membran, da sie vom Cross-flow stärker erfasst werden und dadurch stärker in Membrannähe positioniert werden. Nach erfolgter Fokussierung/Relaxation wird der Kanalfluss wieder zugeschaltet, während der Querfluss erhalten bleibt. Durch das laminare Strömungsprofil des Hauptkanalflusses werden nun die kleineren, mehr in mittlerer Höhe des Kanal befindlichen Teilchen schneller aus dem Kanal transportiert als die größeren Moleküle. Deshalb eluieren, im Gegensatz zur SEC, die kleineren Teilchen in der AF4 zuerst.

Die aufgetrennten Probenbestandteile werden dann on-line charakterisiert. Dazu verwendet man am besten Mehrwinkel-Lichtstreudetektoren (multi angle light scattering, MALS), z.B. den Wyatt DAWN HELEOS, der die Molmassen und Gyrationsradien mit höchster Präzision und Reproduzierbarkeit bestimmt. Die Zweckmäßigkeit einer Kopplung von AF4 und MALS ist in der Literatur schon länger beschrieben und kann inzwischen als etablierte analytische Methodik gelten. Die Bestimmung der Konzentration der eluierenden Komponenten wird in den hier dargestellten Beispielen mit einem RI-Detektor durchgeführt.

Instrumentelle Ausrüstung und Probenmaterial
Zur Ermittlung der dargestellten Daten wurden folgende Instrumente benutzt: Wyatt Eclipse AF4-System, gekoppelt an einen MALS-Lichtstreudetektor Wyatt DAWN EOS und ein Waters 410 RI-Detektor.

Für SEC/MALS kamen ein Trennmodul Waters Alliance 2695, 2 Säulen PLgel Mixed C-300, ein Wyatt miniDAWN MALS-Photometer sowie ein Waters RI-Detektor 2414 zum Einsatz.

Untersucht wurden ein verzweigtes Polystyrol, ein Acryl-Copolymer, organische Nanopartikel sowie ein lineares Polystyrol mit breiter Molmassenverteilung (Aldrich). Alle Proben waren in THF gelöst.

Abbildung 1: Fraktogramme der Trennung einer breit verteilten Polymerprobe (Poly(methyl-methacrylat)), mittels SEC (rot) und AF4 (blau)

Abbildung 1: Fraktogramme der Trennung einer breit verteilten Polymerprobe (Poly(methyl-methacrylat)),  mittels SEC (rot) und AF4 (blau)

Ergebnisse und Bewertung

Abbildung 1 zeigt, dass man mit der AF4 (blau) eine Polymertrennung erhält, die mit dem Resultat aus der SEC (rot) vergleichbar ist. Man beachte die zur SEC umgekehrte Elutionsreihenfolge bei der AF4. Trägt man die jeweilige kumulative Massenverteilung auf, so erhält man für beide Methoden fast übereinander liegende Graphen (Abbildung 2). Dies verdeutlicht die nahezu gleiche Effizienz der Trennmethoden.


Abbildung 2: Kumulative Massenverteilung der Polymerprobe aus Abb. 1. Kongruente Graphen zeigen vergleichbare Trennleistungen an (SEC rot, AF4 blau)

Abbildung 3 zeigt einen so genannten Konformationsplot, in dem der RMS-Radius gegen die Molmasse aufgetragen ist. Daran kann man gut erkennen, ob eine Probe stark verzweigt ist oder nicht. Um verlässliche Aussagen treffen zu können, kommt es dabei besonders auf eine effektive Trennung an. Auch hier offenbaren sich die praktisch identischen Separationsleistungen beider Methoden an den kongruenten Graphen.


Abbildung 3: Auch die Konformationsplots sind für beide Methoden fast deckungsgleich. Farben wie in Abb. 2.

Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet der SEC-MALS-Technik ist die Charakterisierung verzweigter Polymere. Auch hierbei greift man auf den Konformationsplot zurück, denn man kann daran die Zahl der Verzweigungen in Relation zur Molmasse abschätzen. Nun ist es eine Eigenschaft großer, verzweigter Polymere, mit dem Säulenmaterial in Wechselwirkung zu treten und sich mit den Verzweigungen in den Poren der Säulenpackung zu verfangen („anchoring“). In der Folge kommt es natürlich zu einer verzögerten Elution der betroffenen Komponenten, was seinen Niederschlag in einem abnormalen Erscheinungsbild des Konformationsplots findet. Dieses „anchoring“ kann in einem AF4-Trennkanal natürlich nicht vorkommen, denn hier gibt es kein Säulenmaterial. Abbildung 4 zeigt den Vergleich beider Trennmethoden.


Abbildung 4: Bei der Trennung großer, verzweigter Polymere kann die AF4 der SEC überlegen sein (siehe Text, Farben wie in Abb. 2).

Die SEC-Trennung (rot) zeigt in der linken Hälfte einen atypischen Verlauf in Form eines schräg-u-förmigen Musters. Dies deutet darauf hin, dass ein Teil der Probe aufgrund der Interaktion mit der Säule atypisch eluiert, so dass der Plot nicht in der üblichen Weise auswertbar ist.

Dieser Effekt tritt bei der Feldflussfraktionierung nicht auf (blau). Vielmehr ist hier ein  Verlauf zu sehen, wie er charakteristisch ist für eine nach dem Zufallsprinzip verzweigte Probe, mit einer  leicht abnehmenden Steigung im Bereich der großen Molmassen. Hier zeigt sich eine der Stärken der AF4-Technik, nämlich ihre Fähigkeit, Molmassen über einen besonders weiten Bereich zu trennen, und zwar ohne jegliche Änderung der Bedingungen.

Abbildung 5: Die Trennung zweier Nanopartikelfraktionen und die on-line-Analyse mittels MALS liefert eine genaue Charakterisierung der Komponenten (siehe Text).


Dies macht die AF4 auch zu einer idealen Trennmethode für Nanopartikel, wie das Beispiel in Abbildung 5 zeigt. Deren Größenverteilung ist ein wichtiger Parameter, mit dessen Hilfe man Aussagen über ihre Eigenschaften treffen kann. Dargestellt ist hier die Trennung zweier Nanopartikelproben, die auf Basis von Acrylpolymeren hergestellt wurden. Neben den unterschiedlichen Molmassen lassen sich mithilfe der MALS-Messung auch die genauen RMS-Radien der Partikelfraktionen bestimmen.


Zusammenfassung
Die Kombination aus Feldflussfraktionierung und MALS kann als Routinemethode zur Polymeranalyse eingesetzt werden. Dabei liefert die AF4 zumindest der SEC ebenbürtige Trennergebnisse, im Falle von hochmolekularen und  verzweigten Polymeren ist sie sogar die überlegene Methode. Überdies erlaubt die Kombination aus AF4 und MALS auch die Trennung und Charakterisierung von Nanopartikeln. Die Möglichkeit, in einem experimentellen Aufbau sowohl SEC als auch AF4 einzusetzen, macht die Feldflussfraktionierung mit der Eclipse in Kombination mit der Lichtstreuungsmessung zu einem universellen, leistungsfähigen Werkzeug für die Analyse einer Vielzahl von Polymeren und Partikeln.


Literatur

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