RZPD entwickelt siRNA-Ressourcen für das Gene Silencing

15.01.2004: Wissenschaftler des RZPD haben kürzlich einen effizienteren Weg bei der spezifischen Hemmung von Genfunktionen - wichtig bei der Bestimmung von neuen Angriffszielen für innovative Medikamente - mit Hilfe von Ribonukleinsäuren (RNAs) entwickelt. Bislang wurden hierfür sogennante siRNAs (small interfering RNAs)-Moleküle eingesetzt, die die Fähigkeit besitzen, bestimmte Gene in ihrer Funktion auszuschalten (gene silencing) und somit einen Hinweis liefern, welche Erbanlagen für die Ausprägung einer Körperfunktion zuständig sind.

Der Einsatz dieser Moleküle erweist sich aber zum Teil als ineffizient, darüber hinaus ist die bisher eingesetzte chemische Herstellung kostenaufwendig, ihr Einsatz bei Hochdurchsatz-Verfahren unrentabel.

Jetzt hat das RZPD ein Verfahren vorgestellt, mit dem sich effiziente siRNAs rentabel herstellen lassen. Ausgangspunkt sind bislang mehr als 2.300 verschiedene, hochspezifische lange dsDNAs, aus denen sich über zweienzymatische Schritte die siRNAs-Moleküle herstellen lassen. Diese Moleküle werden zur Zeit in Kooperation mit dem Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik, Dresden in Modellversuchen eingesetzt.

Das RZPD erweitert derzeit den vorhandenen Satz an siRNA-Ressourcen. Es wird davon ausgegangen, dass bis Ende 2004 etwa 36.000 genspezifische Produkte für den Menschen zur Verfügung stehen. Darüber hinaus arbeitet das RZPD an entsprechenden Materialien für Maus und Ratte, die bereits in diesem Frühjahr bereitstehen sollen.

Hintergrund:

RNA-Interferenz (RNAi) wird als wichtige Methode bei der Validierung beziehungsweise Identifizierung neuer Targets für medizinische Wirkstoffe angesehen.Die Moleküle eignen sich hervorragend als Hilfsmittel zur Hemmung bestimmter Genprodukte (Gene Silencing Tool) bei der Genfunktionsbestimmung und als vielversprechende Therapeutika.

Ein wichtiges Charakteristikum des Mechanismus ist das Prozessieren von langen dsRNAs in 21 bis 23 Nukleotide, die siRNAs, durch den Dicer-Enzymkomplex. Die siRNA bildet mit einem Proteinkomplex den sogenannten RNA-induced Silencing Complex (RISC), dieser bindet an den Antisense-Strang des 21-mers und schneidet die mRNA in der Mitte des Hybrides. Die mRNA-Degradation führt zu einem "gene silencing" auf posttranskriptioneller Ebene. Ursprünglich wurden 21 bp dsRNAs für den "Knock down" in menschlichen, murinen und Rattenzellen beschrieben. Deren Einsatz hat jedoch drei wesentliche Nachteile: 1. eine ungewisse Erfolgsrate (im Allgemeinen werden zwei bis drei verschiedene siRNA-Oligos gebraucht, um einen "Knock down" zu erreichen), 2. die Effizienz ist meist gering, und 3. die Kosten für siRNA Oligonukleotide belaufen sich auf mehrere Hundert Euro pro Gen, wodurch ein Genomweites Screening behindert wird.

Daher arbeitet das RZPD seit einiger Zeit an einem alternativen Weg des "gene silencing": Dem Einsatz von in vitro-Transkription und rekombinanten RNA verdauenden Enzymen zur Herstellung von funktionellen siRNAs.

Dafür wurden genspezifische Produkte für 36.000 Unigene Clustern hergestellt und verifiziert. Dabei handelt es sich um PCR-Produkte, die mit zwei spezifischen Primern pro Gen hergestellt wurden und keinerlei repetitive beziehungsweise konservierte Sequenzen enthalten. Um diese dsDNA in dsRNA umwandeln zu können, wurden T7-Promotoren angefügt. Diese Produkte lassen sich sehr leicht über in vitro-Transkription in dsRNA-Moleküle überführen. Diese "langen" dsRNA Moleküle können mittels Dicer oder RNaseIII-Reaktion in funktionelle "kleine" siRNAs überführt werden. Diese Endprodukte haben sich als potente "Tools" für den spezifischen "Knock down" erwiesen, die oft den siRNA-Oligos überlegen sind.