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Nanopartikel und Proteine messen

Ulf Nobbmann, Market Specialist - Biophysical Characterization, Malvern Instruments Ltd., UK
Renate Hessemann. Marketing Manager Europe, Malvern Instruments, Germany

Die Zielsetzung der Partikelgrößenbestimmung im Nano- und Submikronbereich, der sich von ca. 0,6 nm bis 6 µm erstreckt, ist sehr vielschichtig.

Messungen in höheren Konzentrationen:
Da sind zum Beispiel Emulsionen oder kolloidale Lösungen für unterschiedlichste Anwendungsgebiete. Einerseits dienen Emulsionen in vielen Bereichen pharmazeutischer Formulierungen, deren Wirkstoffe im Nanobereich liegen, als Trägermaterialen. Andererseits ist es oft die Grundemulsion an sich oder ein kolloidales System anorganischer supendierter Partikel, was von großer Bedeutung ist.

Die Partikelgröße beeinflusst das physikalische Verhalten wie z.B. die Viskosität des Bulk Materials aber auch die Stabilität einer Emulsion und somit deren Haltbarkeit. Partikelgrößenbestimmung wird häufig eingesetzt, um das Brechen einer Emulsion, das mit Tröpfchenwachstum beginnt, über einen gewissen Zeitraum zu beobachten, Dabei wird die Emulsion auch Stressbedingungen ausgesetzt, und das Verhalten unter Stress in kurzen Zeiträumen als Hinweis auf die Lagerstabilität unter normalen Umgebungsbedingungen gewertet. Eine Herausforderung an die Messmethode ist die Konzentration, da Verdünnung fast unweigerlich zu Änderungen des fundamentalen Verhaltens von Emulsionen und somit der Partikelgrößenverteilung führt. Aggregate oder agglomerierte Emulsionströpfchen, die möglicherweise im Ausgangsmaterial vorhanden sind, werden aufgelöst, wenn das disperse System verdünnt wird.

Messung von geringen Konzentrationen und nur sehr schwach streuenden Proben
Neben der Bestimmung konzentrierter Systeme sind besonders sehr stark verdünnte Systeme die Herausforderung an die Messmethode. Dies kommt bei der Messung von Proteinen und Polymeren zum Tragen, wo hoch sensitive Messungen des gestreuten Lichts aufgrund sehr kleiner Moleküle und extrem geringer Konzentration erforderlich sind.

Die Größe von Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung zu messen kann mit Lichtstreutechniken erreicht werden kann. Die Funktionalität der Proteine hängt eng mit ihrer Struktur zusammen. Aus diesem Grund bestehen höchste Bedenken gegen jegliche Form der Probenvorbereitung, die eventuell die Struktur der Proteine verändern könnte, wie sie z.B. bei der Probenvorbereitung für TEM-Messungen nötig ist.

Abb. 1: Größenbereiche verschiedener Anwendungen, bei denen die dynamische Lichtstreuung eingesetzt wird.

Welche Informationen bringt diese Messtechnik bei der Messung von Proteinen?
Bei der Strukturbestimmung von Proteinen ist einer der zeitraubendsten Schritte die tatsächliche Kristallisation, bzw. die Suche nach den Bedingungen, unter denen das Protein kristallisiert. Da dieses Screening eine Fülle verschiedener Pufferzustände mit einbezieht und die Proteinmenge zudem häufig sehr begrenzt ist, ist es verbreitete Praxis geworden, die Eignung des Ausgangsmaterials per Lichtstreuung zu überprüfen. Ein einfaches Lichtstreuexperiment klärt die Größe und die Polydispersität, also die Nichthomogenität der Ausgangsprobe, auf. Die Messung ist schnell und erfordert nur kleine Volumina, wobei die Probe intakt und für weitere Analysen zur Verfügung bleibt.
Die Größe selbst kann mit dem Molekulargewicht des Proteins in Relation gesetzt werden. Während es ungewöhnliche Formeffekte geben kann, neigen viele Proteine dazu, sich wie quasi kugelförmige Moleküle zu benehmen. Von diesen wiederum kann dann erwartet werden, dass sie sich entsprechend der Mark-Houwink-Relation verhalten, d.h. dass die gemessene Teilchengröße mit dem Molekulargewicht durch ein Potenzgesetz zusammenhängt.

Ein ’unbekanntes’ Protein kann dadurch einfach aufgrund seiner gemessenen Größe mit dem erwarteten geschätzten Molekulargewicht verglichen werden. So lässt sich durch die Größe der oligomere Zustand des Proteins in gelöster Form voraussagen. Da die gemessene Größe ein Bild liefert, wie die Moleküle in der Probe unter den gegenwärtigen Bedingungen vorliegen, gibt sie Einblick in die tatsächliche oligomere Konfiguration. Dazu ist jedoch eine angemessene Datenqualität erforderlich. Sehr polydisperse Proben sind für solche Datendeutung nicht verwendbar. Polydispersität ist die Breite der Partikelgrößenverteilung. Sind viele unterschiedliche Partikelsorten in einem zu messenden Volumen anwesend, wird die Breite der Partikelgrößenverteilung größer sein, als wenn alle Streupartikel von der gleichen Sorte sind. Soll zudem noch die Löslichkeit bei unterschiedlichen Pufferlösungen untersucht werden, bringt Lichtstreuung die schnellste Antwort. Sie liefert die Teilchengröße (die eine Schätzung des oligomeren Zustandes des Proteins erlaubt) und Aussagen über die Polydispersität (welche die Homogenität der Verteilung in gelöster Form zeigt). Die Einfachheit und Geschwindigkeit dieser Messtechnik hat Vorteile in der Proteinkristallisation, Proteinstabilitätsanalyse, Messung thermischer Eigenschaften, sowie von Spontanaggregation oder, zusammengefasst gesagt, in der molekularen Charakterisierung in gelöster Form gezeigt.

Molekülgröße und Molekulargewicht
Der Zetasizer Nano hat die Möglichkeit, die Molekülgröße von Molekülen kleiner 1000 Da zu messen. Ebenso kann das Molekulargewicht unter Verwendung des Debye-Plots aus den Lichtstreudaten bestimmt werden.

Abb. 2: Zetasizer Nano

Aus diesem Plot lassen sich das absolute Molekulargewicht und der zweite Virialkoeffizient berechnen. Kenntnisse über den zweite Virialkoeffizienten sind von Bedeutung, um bei der Herstellung von Proteinen die besten Bedingungen zu ermitteln, die zu einer optimalen Kristallisation des Proteins führen. Von den Kristallen hoher Qualität wird dann per Röntgenspektrometrie die Struktur bestimmt.

Optimale Messposition für die jeweilige Probenkonzentration bietet neue Wege bei der Partikelgrößenbestimmung mit dynamischer Lichtstreuung
Üblicherweise wurde die Partikelgröße im Nanometerbereich mit Hilfe von Lichtstreutechniken wie der dynamischen Lichtstreuung (DLS) bestimmt, die auf der Brownschen Molekularbewegung beruhen, wobei die Viskosität des Lösungsmittels berücksichtigt wird.

Herkömmliche DLS Techniken haben jedoch ihre Grenzen. Einerseits muss die Probenkonzentration hoch genug sein, um sicherzustellen, dass genügend gestreutes Licht die Detektoren erreicht, andererseits besteht das Risiko, dass fehlerhafte Ergebnisse erzielt werden, wenn es zu Mehrfachstreuungen kommt. Dies zeigt, dass bezüglich des Konzentrationsbereichs sehr enge Grenzen gesetzt sind.

Die optische Konfiguration der „Non invasive back scatter technology (NIBS®) ist eine neuartige Anordnung der Optik in Partikelanalysegeräten auf Basis der Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) und maximiert die Detektion des gestreuten Lichts bei gleichzeitig optimiertem Signal-Rausch-Verhältnis.
Sie vereint hohe Sensitivität und die Möglichkeit, auch bei höheren Konzentrationen in einem einzigen System zu messen. Damit decken Systeme auf der Basis von NIBS einen Anwendungsbereich ab, für den früher drei klassische Lichtstreusysteme erforderlich waren.

Abb. 3: Um das Messvolumen möglichst groß zu wählen, liegt die Messposition bei kleinen Partikeln sowie verdünnten Proben nahe dem Messzellenzentrum. Für höher konzentrierte Proben liegt sie nahe der zum Laser hingewandten Messzellenwand, um den Weg des Lichts durch die Probe möglichst gering zu halten und Mehrfachstreuung zu verhindern.

Die Geräte bietet die Möglichkeit, durch automatische Positionierung die optimale Messposition zu finden, die genau auf die Charakteristika der zu messenden Probe abgestimmt ist. Die optimale Messposition in der Zelle hängt von der Probenkonzentration ab. Um das Messvolumen möglichst groß zu wählen, liegt diese bei kleinen Partikeln sowie verdünnten Proben nahe dem Messzellenzentrum. Für höher konzentrierte Proben liegt sie nahe der zum Laser hingewandten Messzellenwand, um den Weg des Lichts durch die Probe möglichst gering zu halten und Mehrfachstreuung zu verhindern. Klassische Lichtstreusysteme liefern auf Grund der Mehrfachstreuung (Multiple Scattering), die dadurch auftritt, wenn das von einem Partikel gestreute Licht auf weitere Partikel trifft und nochmals gestreut wird, bevor es den Detektor erreicht, falsche Ergebnisse.

Die automatische Optimierung der optischen Weglänge und die Detektion der Rückstreuung im Gegensatz zur typischen Detektion im 90°-Winkel verbessert die Sensitivität der Messung und gewährleistet, dass der Einfluss durch Mehrfachstreuung auf ein Minimum reduziert wird.

Dadurch erklärt sich die hohe Sensitivität für Proben bis zu einer Verdünnung von 0,1ppm und andererseits die Möglichkeit, selbst Proben bis zu einer Konzentration von 20vol% messen zu können.

Technologie für heute
Neue Technologien wie NIBS verbessern die Partikelmessung erheblich und erleichtern den Einsatz der Messtechnik für eine Vielzahl von Applikationen. Insbesondere bietet sie eine einzigartige Lösung für die wachsenden Anforderung an die Charakterisierung von Nanopartikeln unter einem sehr großen Spektrum unterschiedlichster Umgebungsbedingungen.