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Ultra-schnelle Trennung von Enantiomeren durch Supercritcal Fluidchromatography (SFC) mit gepackten Säulen

Supercritical Fluid Chromatographie mit gepackten Säulen (pSFC) wird vielfach als effektivste, chromatographische Methode anerkannt, wenn es um die Trennung von Racematen in Forschung und Entwicklung neuer Wirkstoffe geht [1,2].
Um dem wachsenden Zeitdruck in der pharmazeutischen Forschung zu begegnen, kann pSFC vielfältigen Nutzen bringen. Die mobile Phase, flüssiges CO2 gemischt mit Methanol als Modifier, hat eine sehr geringe Viskosität und eine hohe Diffusivität, was die Geschwindigkeit der Trennung um den Faktor 4-5 gegenüber der klassischen HPLC erhöht. Bei chiralen Trennungen nicht selten um das 10-20-fache.
Das Van-Deemter Diagramm zeigt, dass für die SFC in einem großen Bereich von Flussraten ihre Auflösung nahezu konstant bleibt. Trotzdem liegen typische Flussraten der SFC für analytische Trennungen heute zwischen 1 und 5 ml/min. Warum nicht die Flussrate erhöhen, um die Trennzeit zu minimieren ?
Ende 2004 begannen am Center for Combinatorial Excellence der Universität Southampton die Studien zur Methodenentwicklung für eine ultra-schnelle chirale Analyse. Experimentelle Protoypen von kurzen, analytischen Trennsäulen für die pSFC wurden hergestellt. Als Packmaterial kam handelsübliche Daicel Chiralpak-AS Phase zum Einsatz. Dieses Material wurde aus im Labor vorhandenen Säulen gewonnen.
Mit diesen Säulen war es möglich, isokratische Trennungen der Enantiomere mit einer Flussrate von 10 ml/min auszuführen. Die Trennzeiten konnten damit auf ca. 20 Sekunden reduziert werden.

Material und Methoden

Proben
Als Probe kam eine Lösung von 2,2,2-Trifluoro-1-(9anthryl)-Ethanol in Methanol zum Einsatz. Die Konzentration betrug 1mg/ml.

Säulen
Eine handelsübliche 4,6mm x 250mm Daicel Chiralpak AS Säule wurde für die Referenzchromatogramme unter typischen pSFC Konditionen verwendet.
Die experimentellen Säulen mit den Maßen von 4.6mm x 50mm wurden speziell angefertigt. Die Phase einer handelsüblichen 4.6mm x 250mm Daicel Chiralpak AS Säule wurde mittels eines Alltech Slurry Packer mit ca. 210 bar in diese Säulen gepresst.

pSFC Equipment
Es wurde eine Berger SFC^TM MiniGram von METTELR TOLEDO im analytischen Modus benutzt. Die MiniGram benutzt ein System aus Modifier- und Kohlendioxidpumpe, um einen Fluss dieses Gemisches von 1 ml/min bis 10 ml/min zu realisieren. Die Probe wurde durch die Probenschleife eines Autosamplers in diesen Fluss injiziert. Der Fluss führte weiter durch die Säule im Säulenofen zu einem UV Detektor. Der UV Detektor war ausgerüstet mit einer Hochdruckdurchflusszelle mit einer Schichtdicke von 10mm.

Experimentelle Konditionen

Die Tabelle gibt eine Übersicht über die jeweils verwendeten Parameter.

	(1) Referenz	(2) ultra-schnell 4ml/min	(3) ultra-schnell 10ml/min
Säule (Daicel Chiralpak AS, 10µm Porengröße)	4.6mm x 250mm	4.6mm x 50mm	4.6mm x 50mm
Flussrate des CO2-MeOH Gemisches	4 ml/min	4 ml/min	10 ml/min
Mischungsverhältnis (isokratisch)	25% MeOH und 75% CO2	25% MeOH und 75% CO2	22% MeOH und 78% CO2
Säulentemperatur	35°C	35°C	35°C
Systemdruck	100 bar	100 bar	100 bar
Wellenlänge (Absorption)	254 nm	254 nm	254 nm
Probenschleife	10 µl, Full-Loop mode	10 µl, Full-Loop mode	10 µl, Full-Loop mode
Injektionsvolumen	4 µl in 10 sec.	4 µl in 10 sec.	4 µl in 10 sec.
Tab. 1 : Übersicht der experimentellen Parameter

Ergebnis und Ausblick

Abbildung 1: Chromatogramme

Das Referenzchromatogramm (Parameter Set 1) zeigt eine an der Basislinie aufgelöste Trennung der Enantiomere in weniger als 3 min. Die beiden ultra-schnellen Trennungen (Parameter Set 2 und 3) stellen offensichtlich einen Kompromiss aus Geschwindigkeit und Qualität dar. Auch wenn die Trennung in weniger als 20 sec geschieht und die stationäre Phase eine befriedigende Trennung ermöglicht, lässt sich hier keine an der Basislinie aufgelöste Trennung erreichen.
Die Experimente legen nahe, dass mit einer Porengröße von 5 µm unter den experimentellen Bedingungen eine an der Basislinie aufgelöste Trennung zu erreichen ist.

Obwohl es sich bei den vorliegenden Ergebnissen um erste Experimente handelt, lassen sich schon heute verschiedene Applikationsfelder für diese Technologie identifizieren:

• Schnelles Screening der stationären Phase zur Reinigung von chiralen Substanzen
• Monitoring von chiralen Reaktionen
• Zersetzungsstudien von chiralen Substanzen
• Transformationsstudien
• Einzelkristallanalyse von chiralen Kristallisationen

Danksagung

John Langley, Maureen Mordi, CCE University of Southampton,UK
Mettler-Toledo, AutoChem, Inc: Terry Berger, Jennifer Van Anda, Kimber Fogelman, Paul Oakley

Literatur

1	Chester, T.L. and J.D. Pinkston, Analytical Chemistry. 2004, 76, 4606-4613.
2	Ward, Timothy J. and Daisy-Malloy Hamburg, Analytical Chemistry. 2004, 76, 4635-4644.