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Individuelle Anpassung und Automation von Standard-Software im Labor

Dick Mitchell, August 2003, Systat Software

Abstract
Software-Pakete, die von Forschern eingesetzt werden, können oft nicht alle Bedürfnisse als Komplettpaket befriedigen. Zum Glück sind die Anwender aber nicht allein auf das angewiesen, was mit der Installation der Software geliefert wird. Die Aufnahme von Visual Basic für Anwendungen (VBA), (Microsoft), in das wissenschaftliche Graphikprogramm SigmaPlot beweist, dass auch Standardsoftware-Programme an die spezifischen Bedürfnisse individueller Forschungsprojekte angepasst werden können.

Die meisten Analyseabläufe im Labor sind repetitiv und bestehen aus den drei Schritten Datenanalyse, Grapherstellung und Reporterstellung. In Verbindung mit VBA kann SigmaPlot in allen drei Bereichen effizienzsteigernd eingesetzt werden, wie an den Beispielen multiple Kurvenanpassungen, Standardkurven, Ligand Binding und Enzymkinetik gezeigt wird.

SigmaPlot (Systat Software, Erkrath) produziert publikationsfähige Graphen und wird von Wissenschaftlern in allen Forschungsbereichen in breitem Umgang eingesetzt. Das im Programm integrierte VBA und SigmaPlot Automation ermöglichen das Schreiben von Makros, mit denen Daten von wissenschaftlichen Instrumenten analysiert und graphisch dargestellt werden können.

So konnte Arlene Campos, Post-Baccalaureate Intramural Research Training Award (IRTA) fellow am National Institute on Drug Abuse (Baltimore, USA), die Effizienz in ihrem Labor durch die Entwicklung solcher individuellen Makros mit SigmaPlot verbessern. Im Rahmen ihrer Forschungen werden zweimal täglich quotenhäufige Kurven auf der Basis der Daten von 16 Ratten in intrakranialen Selbststimulierungs-Experimenten (ICSS) generiert. Die Daten werden mit dem ICSS Equipment aufgenommen und dann direkt in SigmaPlot importiert.

Das Labor generiert mindestens 32 Graphen pro Tag, manchmal auch mehr. Auf den ersten Blick erscheint das nicht viel, aber es ist außerordentlich zeitintensiv, wenn man 32 mal immer wieder die gleiche Abfolge von Tastenanschlägen und Mausklicks durchführen muß.

An diesem Punkt setzt die Automation an. Campos schrieb eine individuelle Anwendung, mit der automatisch drei Regressionsgleichungen einschließlich Weibull, Gompertz und Logistic auf den Daten berechnet werden. Danach werden zum besseren Verständnis und zur Visualisierung der Daten automatisch Graphen erstellt. Darüber hinaus schrieb Campos ein Makro, mit dem automatisch Transformationen gestartet werden, mit denen Theta 0 und M50-Werte für jede Regressionskurve berechnet werden.

Laut Arlene Campos konnten die Forscher alle gewünschten Aufgaben mit SigmaPlot durchführen. Sie benötigte ungefähr eine Woche, um das Makro zu schreiben, das sie und ein anderer Forscher derzeit in ihrem Labor einsetzen. Durch die entsprechend angepassten Makros sparten die Forscher mindestens 2 Stunden pro Tag und konnten sich stattdessen anderen Forschungsaktivitäten zuwenden. Das war die Mühe sicherlich wert.

Abbildung 1: Standardkurven-Analyse

SigmaPlot verfügt über ein großes Arbeitsblatt mit 32.000 Spalten und 32 Millionen zeilen, einen leistungsfähigen nichtlinearen Curve fitter, eine flexible Graphik-Maschine, und eine spaltenorientierte Programmiersprache. Diese Funktionen werden zur Entwicklung von individualisierten Anwendungen eingesetzt. Einige dieser Anwendungen wurden der SigmaPlot 8.0 Oberfläche unter dem Menüpunkt Pharmakologie hinzugefügt. Die Standardkurven-Analyse ist in Abbildung 1 zu sehen.

Standardkurven-Analyse
Die Erstellung einer Standardkurve erfordert normalerweise das Anpassen einer Kurve an Daten, die von einem Instrument gemessen wurden. Damit wird eine Beziehung zwischen den Standardkonzentrationen des Präparats und den Ergebnissen des Instruments hergestellt. Daraufhin wird ein Graph erstellt und die Güte-der- Anpassung-Werte werden generiert, um die Anpassung der Kurve zu beurteilen. Zuletzt können die Konzentrationen unbekannter Stichproben festgestellt werden, indem die Anpassungsgleichung für die X-Werte mit den unbekannten y-Werten gelöst wird. All diese Operationen sind in SigmaPlot Automation möglich, da ein Makro, mit dem Standardkurven im Labor durchgeführt werden können, integriert ist. Der Dialog für das Standardkurven-Makro wird in Abbildung 2 gezeigt.

Abbildung 2: The standard curve macro dialog. Options are selected to solve for concentrations (X) from measured values (Y) and to create a graph.

Die graphischen Ergebnisse, die mit dem Makro erzielt wurden, sind in Abbildung 3 zu sehen. Das Makro generiert auch numerische Werte für die Wirkstoffkonzentrationen und produziert einen nichtlinearen Regressionsreport, in dem die Qualität der Anpassung begutachtet werden kann.

Abbildung 3: Standardkurven-Makro-Ergebnisse. Der Durchschnittswert und der Standardfehler der replizierten Daten wird zusammen mit der 4PL Kurvenanpassung (durchgezogene Linie) gezeigt. Die Evaluierung von vier unbekannten Ergebnis/Reaktionswerten (Y) für die Wirkstoffkonzentrationen (X) wird mit gestrichelten Linien gezeigt.

Ligand Binding Analyse
Sättigungs- und Konkurrenzanalysen werden eingesetzt, um die Bindung eines Liganden an ein Rezeptormolekül zu untersuchen. Die Datenanalyse besteht aus der Anpassung einer Gleichung an die Daten und der Erstellung von Parametern, die die Affinität des Liganden zu seinem Rezeptor und die Anzahl an Bindungsstellen misst. Hierbei ist es wünschenswert, einen Graphen der angepassten Daten zu sehen und einen Report zu erhalten, der die Parameterwerte und ihre Statistiken anzeigt. Konzeptionell handelt es sich hierbei um das gleiche Analyseproblem wie bei der Standardkurven-Anwendung - eine nichtlineare Kurvenanpassung, Graphik und Report. Der einzige Unterschied besteht in den Details. Ein Makro wird geschrieben, das es dem Anwender ermöglicht, aus einer Gleichungsliste zu wählen (damit wird sowohl Dosis-Wirkungs- als auch Ligand Binding Analyse zur Verfügung gestellt), diese Gleichung an Daten anzupassen, die replizierte Messungen beinhalten, einen Graphen und zuletzt noch einen Report mit den Ergebnissen zu erstellen. Der Makro-Dialog in Abbildung 4 erlaubt außerdem die Anpassung der Anpassungslinien und die Errechnung von Ki aus konkurrierenden EC50 Werten.

Die Ergebnisse der Analyse von 8 Verbindungen werden graphisch in Abbildung 5 und numerisch in Abbildung 6 gezeigt.

Abbildung 4: Ligand Binding Dialog. Acht Verbindungen, jede mit drei Replikationen, werden analysiert. Der Bereich der angepassten Linie wurde leicht über den Bereich der Daten verlängert.

Abbildung 5: Die one-site Konkurrenzgleichungsanpassung an acht Datensätze. Durchschnitt und Standardfehlerbalken werden für die replizierten Daten gezeigt. Anpassungslinien für jeden Datensatz und eine Legende wurden erstellt.

Abbildung 6: Ein Teil des Reports, der mit dem Ligand Binding Makro generiert wird, zeigt die Parameterwerte und ihre Standardfehler für zwei der Verbindungen.

Enzymkinetik-Analyse
Enzymologen verwenden Graphen mit Achsen, die die Quotienten gemessener Variablen sind. Für bestimmte Typen an enzymatischen Reaktionen werden hierdurch Graphiken erstellt, die gerade Linien sind und daher leichter zu interpretieren sind. Es ist jedoch sehr wichtig, Gleichungen mit diesen abgeleiteten Quotientenvariablen anzupassen, da die Fehlercharakteristika der Quotienten den Annahmen für nichtlineare Regression nicht genügen. So könnten signifikante Fehler in den angepassten Parametern erscheinen. Das Enzymkinetik-Modul, ein Add-on für SigmaPlot, führt Anwender durch die Dateneingabe, Analyse und graphische Darstellung enzymkinetischer Daten. Das Modul wurde entwickelt, um nichtlineare Regressionen durchzuführen, bei denen die Geschwindigkeit gemessener Variablen, Substrate und Inhibitorkonzentrationen eingesetzt werden. Im Anschluß an die Messungen werden SigmaPlot Makros zur Generierung von Graphen eingesetzt. Einige dieser Makros sind ziemlich kompliziert, da die Variabelquotienten zu numerischen Besonderheiten führen, die näher untersucht werden müssen. Dank der Möglichkeiten von VBA und SigmaPlot Automation können diese Graphen erstellt werden. Beispiele dieser Graphen sind in Abbildung 7 zu sehen. Automation wurde in diesen Graphen eingesetzt, um die Plottypen zu spezifizieren (Durchschnitt plus Fehlerbalken von replizierten Daten, gerade Linien für Anpassungen), die Achsenreichweite festzulegen, die Achsen an die gewünschten Positionen zu setzen, individuelle Legenden zu erstellen und andere Funktionen zu produzieren.

Abbildung 7: Beispiele von enzymkinetischen Graphen, die mit dem Enzymkinetik-Modul erstellt wurden. Die Datenpunkte (Durchschnitt +-Standardfehler) wurden von den Rohdaten im Michaelis-Menten Graph generiert. Nichtlineare Regression wurde an den Daten in dem Michaelis-Menten Graph durchgeführt und dann wurden die Anpassungslinien für die anderen Graphen von diesen Ergebnissen berechnet. Das Makro entwickelt zwei Legenden, die im Lineweaver-Burk Graphen zu sehen sind und in den anderen Graphen unterdrückt wurden, um größere Klarheit zu erreichen.

Zusammenfassung
Die Erweiterung von SigmaPlot durch VBA und Automation hat individualisierten Anwendungen im Labor Tür und Tor geöffnet. Diese individuellen Anwendungen können repetitive Aufgaben automatisieren, um die Effizienz der Arbeit aber auch die Integrität der Analysen zu verbessern, indem mehr Tests und komplexere Analysen durchgeführt werden, die zu einem besseren Verständnis der Daten führen. Formatierte Reports können auch in einem Arbeitsblatt oder dem SigmaPlot Report Editor generiert werden, wenn eine Analyse durchgeführt wird. Zusätzlich zur Automatisierung von Aufgaben können qualitativ hochwertige Graphen mit individuell zu den spzifischen Anwendungen passenden ausgewählten Funktionen erstellt werden. Diese Graphen können genutzt werden, um einfach eine visuelle Interpretation der Daten zu bieten, oder als Teil einer Präsentation. Graphen, die in SigmaPlot erstellt wurden, haben Publikationsqualität und werden oft in Fachjournalen veröffentlicht.